基于PiggyBac轉座系統的低溢漏誘導型Tet-On過表達體系的建立及應用

張柏權 李中瀚 殷旖珂

為避免誘導基因穩定表達的Tet-On誘導表達系統溢漏表達，實現簡便且高效的外源基因穩定誘導表達， 本研究擬在Tet-On調控的轉錄水平基礎上，將基于穩定配體Shield-1的不穩定結構域FK506結合蛋白引入目的基因的N端，從蛋白水平控制其本底表達水平.為驗證該系統的效果，本研究以熒光蛋白TdTomato為報告基因，經流式分析結果證明優化后的體系較原體系的溢漏表達在蛋白水平上降低7倍左右.將該系統應用于基于小鼠胚胎干細胞的體外牙向分化模型，在誘導因子Dox和穩定配體Shield-1的協同作用下，誘導表達牙齒發育相關轉錄因子Hand2提高了牙向分化誘導的完成度.

PiggyBac轉座系統； Tet-on誘導型過表達系統； 溢漏表達； 不穩定結構域； 穩定配體Shield-1

Q28A2023.036004

收稿日期： 2022-08-15

基金項目： 國家自然科學基金青年基金（31900900）

作者簡介： 張柏權（1997-）， 男， 陜西西安人， 碩士研究生， 主要從事細胞生物學研究. E-mail： 248857314@qq.com

通訊作者： 殷旖珂．E-mail： ytyike@outlook.com

Establishment and application of a low-leakage Tet-On inducible overexpression system based on the PiggyBac transposition system

ZHANG Bai-Quan， LI Zhong-Han， YIN Yi-Ke

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064）

In order to avoid the leakage expression of the Tet-on inducible expression system and to achieve easy， stable and efficient expression of exogenous gene when induced at a specific time， this study planned to add the destabilizing domain FK506-binding protein， regulated by the stable ligand Shield-1， to the N-terminal of the target gene to control its background expression at the protein level. To verify the performance of this system， the fluorescent protein TdTomato was used as the reporter gene in this study. The results of flow analysis showed that the leakage expression in the optimized system was reduced about 7 times compared with the original one at the protein level. This system was applied to the in vitro odontogenic induction system based on mouse embryonic stem cells. Under the synergistic effect of the inducible factor Dox and the stable ligand Shield-1， the induced overexpression of tooth development-related transcription factor Hand2 could improve the completion of odontogenic induction.

PiggyBac transposition system; Tet-On inducible overexpression system; Leakage expression; Destabilizing domain; Stable ligand Shield-1

1 引 言

在發育生物學中，某些關鍵基因在特定時間段的表達，是實現體外組織器官再生的關鍵步驟，利用Cre-loxP、Tet-On等系統可在體外實現特定基因的定時表達［1-4］.其中，Cre-loxP系統實現對目的基因表達開啟是不可逆的［2， 5］.而Tet-On系統憑借其添加或去除誘導因子Dox實現目的基因表達起始或停止這一優勢，而被廣泛使用［3， 6］.通常情況下，在Tet-On過表達系統中，持續表達的rtTA處于游離狀態，不會結合誘導型tetO啟動子，無法起始目標基因的表達；而在添加了四環素誘導因子（Doxycycline， Dox）后，Dox結合rtTA并改變其構象，使其結合于tetO啟……