復方靈丹膠囊對肝纖維化小鼠模型肝功能及纖維化程度的影響

涂芷馨 王妍 黃劍潔 金清龍

摘要：目的 研究復方靈丹膠囊對肝纖維化小鼠模型血清生化指標及肝臟纖維化程度的影響。方法 125只SPF級雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（n=5）；CCl4模型組（n=15），CCl4造模低、中、高劑量給藥組（0.8、1.6、3.2 mg·g-1·d-1）（每組各15只）；DDC模型組（n=15），DDC造模低、中、高劑量給藥組（0.8、1.6、3.2 mg·g-1·d-1）（每組各15只）。造模成功后，給藥組予以相應劑量復方靈丹膠囊混懸液灌胃，正常對照組及模型組以等量生理鹽水灌胃，連續給藥4周，眼球取血，留取血清，檢測AST、ALT、白蛋白、膽紅素，留取肝右葉同一部位組織進行病理觀察及天狼星紅、α1-Ⅰ型膠原蛋白抗體及α-平滑肌肌動蛋白抗體染色。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。結果 與模型組對比，復方靈丹膠囊給藥后，各劑量組小鼠血清ALT明顯下降、白蛋白升高（P值均＜0.05），中、高劑量給藥組血清AST、膽紅素水平均降低 （P值均＜0.05），且各指標高劑量組較低劑量組差異更顯著（P值均＜0.05）。各劑量組小鼠肝組織病理變化均得到不同程度的改善，天狼星紅染色陽性細胞顯著減少，α-平滑肌肌動蛋白、α1-Ⅰ型膠原蛋白表達出現不同程度的下降。結論 復方靈丹膠囊能夠改善肝纖維化小鼠肝功能、降低其肝纖維化程度。

關鍵詞：肝硬化； 小鼠， 近交C57BL； 復方靈丹膠囊

基金項目：國家自然科學基金（81270484）

Effect of Compound Lingdan Capsule on liver function and fibrosis degree in mice with liver fibrosis

TU Zhixin， WANG Yan， HUANG Jianjie， JIN Qinglong. （Department of Hepatology， The First Hospital of Jilin University， Changchun 130000， China）

Corresponding author：

JIN Qinglong， jinql@jlu.edu.cn（ORCID：0000-0002-4626-9828）

Abstract：

Objective To investigate the effect of Compound Lingdan Capsule on serum biochemical parameters and liver fibrosis degree in a mouse model of liver fibrosis. Methods A total of 125 specific pathogen-free male C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group with 5 mice， CCl4 model group with 15 mice， low-， middle-， and high-dose CCl4 groups （0.8， 1.6， and 3.2 mg·g-1·d-1） with 15 mice in each group， DDC model group with 15 mice， and low-， middle-， and high-dose DDC groups （0.8， 1.6， and 3.2 mg·g-1·d-1） with 15 mice in each group. After successful modeling， the mice in the administration groups were given Compound Lingdan Capsule suspension at the respective doses by gavage， and those in the normal control group and the model group were given an equal volume of normal saline by gavage， for 4 consecutive weeks. Blood samples were collected from the eyeballs， and serum was used to measure aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， albumin， and bilirubin. Liver tissue samples were collected at the same site of the right lobe of the liver for pathological observation， Sirius Red staining， α-SMA antibody staining， and COL1A1 antibody staining. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the Bonferroni method was used for further comparison between two groups. Results Compared with the model group， each dose group had significant reductions in the serum level of? ALT? and a significant increase in the serum level of albumin after the administration of Compound Lingdan Capsule （all P＜0.05），? the levels of AST and bilirubin in the middle and high dose groups were lower （all P＜0.05）， and the difference of each index in the high dose group was more significant than that in the low dose group （all P＜0.05）. Each dose group had varying degrees of improvement in the pathological changes of the liver and a significant reduction in the number of Sirius Red staining-positive cells， as well as varying degrees of reduction in the protein expression of α-SMA and COL1A1. Conclusion Compound Lingdan Capsule can improve liver function and reduce liver fibrosis degree in mice with liver fibrosis.

Key words：

Liver Cirrhosis； Mice， Inbred C57BL； Compound Lingdan Capsule

Research funding：National Natural Science Foundation of China（81270484）

肝纖維化是由各種因素引起的肝細胞慢性損傷和細胞外基質過度沉積所致，肝纖維化的進一步進展可導致肝硬化甚至肝細胞癌的發生［1-2］。肝纖維化及其并發癥給人類帶來了巨大的醫療和經濟負擔，然而，即便是晚期肝纖維化也是可以逆轉的［2-4］。肝纖維化的基本治療策略是病因治療聯合抗肝纖維化治療［5-6］。然而在臨床上，針對肝纖維化確切有效的藥物較少，而中藥被認為在逆轉肝纖維化方面具有一定的優勢。本單位自主研制的處方藥“復方靈丹膠囊”治療肝纖維化、肝硬化已有數年的用藥經驗，治療患者達數千例，有明顯療效。本研究旨在通過建立肝纖維化小鼠模型，觀察其血清生化指標及肝臟病理形態、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及α1-Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）表達等，驗證復方靈丹膠囊對小鼠肝功能及肝纖維化程度的影響。現將觀察結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠125只，許可證編號：SYXK（吉）2016-0001，體質量18～22 g，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 復方靈丹膠囊由吉林大學第一醫院制備，批號20100701。AST、ALT、膽紅素、白蛋白ELISA試劑盒，α-SMA抗體、COL1A1抗體均由長春萊格瑞生物技術有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模及給藥 將小鼠用簡單隨機化分組法分為正常對照組、CCl4造模組、DDC造模組。CCl4造模組隨機分為CCl4模型組、CCl4-L組、CCL4-M組、CCL4-H組，DDC造模組隨機分為DDC模型組、DDC-L組、DDC-M組、DDC-H組（表1）。

1.3.2 血清生化指標檢測 末次給藥12 h后，小鼠禁食12 h，眼球取血，采用低溫離心方法收集血清樣本，利用ELISA試劑盒檢測小鼠血清內AST、ALT、膽紅素及白蛋白的含量。

1.3.3 HE及天狼星紅染色 4周后麻醉小鼠，取肝右葉同一部位組織，用4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，分別作HE、天狼星紅染色處理，鏡下觀察肝組織形態。

1.3.4 免疫組化 4周后麻醉小鼠，取肝右葉同一部位組織，用4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，將組織切片按標準流程進行α-SMA、COL1A1抗體染色，鏡下觀察。

1.3.5 統計學方法 采用SPSS 25.0和Graghpad Prism 9.0軟件進行數據統計分析和作圖。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清ALT、AST、膽紅素、白蛋白水平 與正常對照組相比，CCl4模型組血清ALT、AST和膽紅素水平均明顯升高，白蛋白水平顯著下降（P值均＜0.05），提示CCl4造模造成小鼠明顯肝損傷。與CCl4模型組相比，復方靈丹膠囊各劑量給藥組小鼠血清ALT顯著降低，白蛋白水平均提升（P值均＜0.05），中、高劑量給藥組血清AST、膽紅素水平均降低（P值均＜0.05），且各指標高劑量組較低劑量組差異更明顯（P值均＜0.05）（表2）。

與正常對照組相比，DDC模型組小鼠血清ALT、AST和膽紅素水平均明顯升高，白蛋白水平明顯下降（P值均＜0.05），提示DDC造模造成小鼠明顯肝損傷。與DDC模型組相比，復方靈丹膠囊中、高劑量給藥組小鼠血清ALT、AST和膽紅素水平明顯降低，白蛋白水平明顯升高（P值均＜0.05）（表3）。

2.2 各組小鼠肝組織不同染色結果

HE染色：正常對照組小鼠肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射性排列，肝細胞間聯系緊密，肝細胞核大而圓，無炎性細胞浸潤；DDC和CCl4誘導小鼠肝纖維化造模組可見匯管區和小膽管周圍淋巴細胞、漿細胞浸潤，膽管上皮細胞變性壞死，基底膜不完整；復方靈丹膠囊給藥后，低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠肝組織病理變化均得到不同程度的改善。

天狼星紅染色：與造模組相比，各劑量組陽性細胞顯著減少。

α-SMA抗體染色：與正常對照組相比，造模組小鼠肝組織中α-SMA蛋白表達增加，復方靈丹膠囊給藥后，肝組織中α-SMA蛋白表達出現不同程度的下降。

COL1A1抗體染色：各劑量組復方靈丹膠囊可以降低小鼠肝組織膠原蛋白的分泌（圖1）。

3 討論

各種原因所致的慢性肝病若不及時治療會導致肝纖維化，并發展為肝硬化，最終可發展致肝衰竭和肝細胞癌，這與肝臟相關病死率密切相關［7-8］。肝纖維化的改善與更好的預后及10年生存率的顯著增加密切相關，因此，有效的抗肝纖維化治療是非常必要的，即使在晚期肝纖維化患者中也是如此［7］。

在抗肝纖維化治療中，最重要的是病因治療。研究［9-13］表明，病因的有效控制可減輕對肝臟的持續損傷，從而促進纖維化肝組織的修復。然而，控制和清除慢性肝損傷的病因并不能立即逆轉肝纖維化，可能需要數年的時間才能實現顯著的肝纖維化消退，而包括門靜脈高壓和肝細胞癌在內的肝纖維化并發癥可能會進一步進展，因此，病因的有效控制和清除不足以改善所有肝纖維化患者的臨床結局，這說明了在病因治療前、治療時及控制或清除病因后采用直接有效的抗肝纖維化治療是十分必要的［1，6］。然而，臨床上目前尚無公認有效的抗肝纖維化的化學藥物或生物制劑［2，6］，但中藥在該領域具有一定的優勢，國內已有多種注冊適應證為肝纖維化的中成藥上市并用于臨床治療［14］。

本單位自主研制的中成藥復方靈丹膠囊由丹參、靈芝、山豆根、葫蘆素四味中藥組成，其功能為“扶正補虛、活血化瘀、清熱利濕”，主治正虛血瘀兼濕熱證所致的病毒性肝炎、肝纖維化等疾病。本制劑按君、臣、佐、使組方原則，分析處方配伍，方中丹參，味苦、微寒，入心、肝經，活血化瘀，為君藥；靈芝，味甘、平，入心、肺、肝、腎經，扶正固本、補氣養血，山豆根，味苦、寒，入肺、胃經，清熱解毒、消腫止痛，兩藥并用，祛除熱、毒、瘀等有形之邪，為臣藥；葫蘆素，為佐藥，可助臣藥清利濕熱、解毒退黃；諸藥合用，標本兼治，共同起到“扶正固本、活血化瘀、清利濕熱”之功效。本制劑安全可靠、療效確切、標準明確、質量可控，符合中醫藥理論和應用標準，體現中藥多成分、多靶點產生作用的特點。

本研究在前期工作的基礎上進一步深入研究，分析了在兩種肝纖維化模型小鼠中復方靈丹膠囊給藥后的效果，并從肝臟病理、免疫組化層面進一步證明復方靈丹膠囊對肝纖維化的療效［15］。本研究表明，復方靈丹膠囊可降低肝纖維化模型小鼠血清AST、ALT、膽紅素水平，提升白蛋白水平，減輕肝小葉結構的破壞及纖維組織增生，可見其有減輕肝損傷、改善肝功能、抑制肝纖維化的作用。免疫組化結果表明，復方靈丹膠囊各劑量組均不同程度地降低了α-SMA和COL1A1蛋白的表達。先前研究［2，16-17］表明，肝細胞受損致肝星狀細胞（HSC）活化，在促纖維形成介質的刺激下，HSC上調α-SMA和其他肌成纖維細胞內微絲的表達，促使HSC遷移到損傷部位并分泌細胞外基質，其中TGFβ是最有效的促纖維化細胞因子，以SMAD2或SMAD3依賴的方式驅動HSC活化，而COL1A1基因被鑒定為活化HSC中TGFβ的靶點［2，16-17］。這表明復方靈丹膠囊改善肝纖維化的作用機制可能與調控上述細胞因子及其相關信號通路有關。本課題組前期工作表明，復方靈丹膠囊聯合恩替卡韋治療代償期乙型肝炎肝硬化患者后，其門靜脈寬度及瞬時彈性成像Fibroscan明顯下降，可見復方靈丹膠囊能夠改善其肝纖維化程度、延緩病情進展。

綜上所述，復方靈丹膠囊能夠改善肝纖維化小鼠肝功能、降低其肝纖維化程度，具有良好的臨床應用價值。但目前尚不清楚復方靈丹膠囊延緩及逆轉肝纖維化的具體機制及調控作用，更進一步的研究還有待進行。

倫理學聲明：本研究方案于2019年6月1日經由吉林大學實驗動物倫理委員會審批，批號：SY201906010，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：涂芷馨負責課題設計，資料分析，撰寫論文；王妍、黃劍潔參與收集數據，修改論文；金清龍負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

參考文獻：

［1］FRIEDMAN SL. Liver fibrosis—from bench to bedside［J］. J Hepatol， 2003， 38（Suppl 1）： S38-S53. DOI： 10.1016/s0168-8278（02）00429-4.

［2］

KISSELEVA T， BRENNER D. Molecular and cellular mechanisms of liver fibrosis and its regression［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2021， 18（3）： 151-166. DOI： 10.1038/s41575-020-00372-7.

［3］

WEISKIRCHEN R， WEISKIRCHEN S， TACKE F. Recent advances in understanding liver fibrosis： bridging basic science and individualized treatment concepts［J］. F1000Res， 2018， 7： F1000 Faculty Rev-921. DOI： 10.12688/f1000research.14841.1.

［4］

DU WT， REN WL， HU DD， et al. Research progress on reversible animal model of liver fibrosis［J/CD］. Chin J Liver Dis （Electronic Version）， 2022， 14（3）： 18-21. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2022.03.005.

杜文濤， 任萬雷， 胡豆豆， 等. 肝纖維化可逆轉動物模型研究進展［J/CD］. 中國肝臟病雜志（電子版）， 2022， 14（3）： 18-21. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2022.03.005.

［5］

Chinese Society of Hepatology， Chinese Medical Association; Chinese Society of Gastroenterology， Chinese Medical Association; Chinese Society of Infectious Diseases， Chinese Medical Association. Consensus on the diagnosis and therapy of hepatic fibrosis （2019）［J］. J Clin Hepatol， 2019， 35（10）： 2163-2172. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.10.007.

中華醫學會肝病學分會， 中華醫學會消化病學分會， 中華醫學會感染病學分會. 肝纖維化診斷及治療共識（2019年）［J］. 臨床肝膽病雜志， 2019， 35（10）： 2163-2172. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.10.007.

［6］Liver Disease Committee， Chinese Association of Integrative Medicine. Guidelines for the diagnosis and treatment of liver fibrosis in integrative medicine practice （2019）［J］. J Clin Hepatol， 2019， 35（7）： 1444-1449. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.007.

中國中西醫結合學會肝病專業委員會. 肝纖維化中西醫結合診療指南（2019年版）［J］. 臨床肝膽病雜志， 2019， 35（7）： 1444-1449. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.007.

［7］

PAROLA M， PINZANI M. Liver fibrosis： Pathophysiology， pathogenetic targets and clinical issues［J］. Mol Aspects Med， 2019， 65： 37-55. DOI： 10.1016/j.mam.2018.09.002.

［8］

LAI M， AFDHAL NH. Liver fibrosis determination［J］. Gastroenterol Clin North Am， 2019， 48（2）： 281-289. DOI： 10.1016/j.gtc.2019.02.002.

［9］

HAMMEL P， COUVELARD A， OTOOLE D， et al. Regression of liver fibrosis after biliary drainage in patients with chronic pancreatitis and stenosis of the common bile duct［J］. N Engl J Med， 2001， 344（6）： 418-423. DOI： 10.1056/NEJM200102083440604.

［10］ARTHUR MJ. Reversibility of liver fibrosis and cirrhosis following treatment for hepatitis C［J］. Gastroenterology， 2002， 122（5）： 1525-1528. DOI： 10.1053/gast.2002.33367.

［11］

KWEON YO， GOODMAN ZD， DIENSTAG JL， et al. Decreasing fibrogenesis： an immunohistochemical study of paired liver biopsies following lamivudine therapy for chronic hepatitis B［J］. J Hepatol， 2001， 35（6）： 749-755. DOI： 10.1016/s0168-8278（01）00218-5.

［12］

DIXON JB， BHATHAL PS， HUGHES NR， et al. Nonalcoholic fatty liver disease： Improvement in liver histological analysis with weight loss［J］. Hepatology， 2004， 39（6）： 1647-1654. DOI： 10.1002/hep.20251.

［13］

CZAJA AJ， CARPENTER HA. Decreased fibrosis during corticosteroid therapy of autoimmune hepatitis［J］. J Hepatol， 2004， 40（4）： 646-652. DOI： 10.1016/j.jhep.2004.01.009.

［14］

ZHANG Y， LYU WL. Visual analysis of traditional Chinese medicine in the treatment of hepatic fibrosis based on CiteSpace［J］. China Med Herald， 2022， 19（19）： 129-132， 137.

張亞， 呂文良. 基于CiteSpace中醫藥治療肝纖維化的可視化分析［J］. 中國醫藥導報， 2022， 19（19）： 129-132， 137.

［15］

WANG HY， NIU JQ， ZHANG WY， et al. Experimental study on the anti-hepatic fibrosis effect of Compound Lingdan Capsule［J］. Chin Traditional Patent Med， 2014， 36（1）： 168-171. DOI： 10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.042.

王化宇， 牛俊奇， 張煒煜， 等. 復方靈丹膠囊抗肝纖維化作用的實驗研究［J］. 中成藥， 2014， 36（1）： 168-171. DOI： 10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.042.

［16］

FALLOWFIELD JA， MIZUNO M， KENDALL TJ， et al. Scar-associated macrophages are a major source of hepatic matrix metalloproteinase-13 and facilitate the resolution of murine hepatic fibrosis［J］. J Immunol， 2007， 178（8）： 5288-5295. DOI： 10.4049/jimmunol.178.8.5288.

［17］

DOOLEY S， DELVOUX B， STRECKERT M， et al. Transforming growth factor beta signal transduction in hepatic stellate cells via Smad2/3 phosphorylation， a pathway that is abrogated during in vitro progression to myofibroblasts. TGFbeta signal transduction during transdifferentiation of hepatic stellate cells［J］. FEBS Lett， 2001， 502（1-2）： 4-10. DOI： 10.1016/s0014-5793（01）02656-4.

收稿日期：

2022-09-07；錄用日期：2022-10-24

本文編輯：林姣