沙棘熊果酸通過調節線粒體-細胞色素c抑制酒精性肝病大鼠模型肝細胞凋亡的作用分析

包艷紅 王強 張文龍 戈娜 李楠 蘇軍 李可欣

摘要：

目的 基于線粒體-細胞色素c途徑探討沙棘熊果酸對酒精性肝病大鼠肝細胞凋亡的抑制作用。方法 根據隨機數字表將50只SPF級雄性Wistar大鼠進行完全隨機分組，分為正常對照組、酒精模型組、沙棘熊果酸低、中和高劑量組，每組10只。正常對照組給予每日1次生理鹽水灌胃8周；酒精模型組用階梯式濃度酒精灌胃的方法持續灌胃8周；沙棘熊果酸組分別按50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg灌胃，1 h后再灌喂模型組同等劑量酒精。測定各組大鼠血清肝功能指標；HE染色觀察肝組織病理情況；電鏡下觀察大鼠肝細胞超微結構；TUNEL法檢測大鼠肝細胞凋亡情況；Western Blot法檢測肝細胞線粒體和胞漿細胞色素c和活化caspase-3蛋白表達水平。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果 與酒精模型組相比，沙棘熊果酸中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和膽堿酯酶水平均下降（P值均＜0.05）；酒精模型組大鼠肝細胞索排列紊亂，肝細胞水腫、脂肪變性明顯，而沙棘熊果酸中、高劑量組大鼠肝細胞索排列逐漸趨于正常、肝脂肪變性明顯改善；肝細胞線粒體數目增加、形態明顯改善；肝細胞凋亡率、胞漿細胞色素c和活化caspase-3蛋白的表達均低于酒精模型組（P值均＜ 0.05）。結論沙棘熊果酸可改善酒精性肝病大鼠肝功能和肝組織形態，可能與抑制肝細胞線粒體細胞色素c的釋放及caspase-3蛋白的活化，通過線粒體-細胞色素c途徑抑制肝細胞凋亡有關。

關鍵詞：

肝疾病， 酒精性； 沙棘；?? 細胞凋亡； 線粒體； 細胞色素c類

基金項目：

國家自然科學基金（81550044， 81760586）；內蒙古自治區自然科學基金（2014MS0303）； 內蒙古自治區高等學校“青年科技英才計劃”項目（NJTY-15-B11）； 內蒙古自治區衛生計生科研計劃項目（201701084）； 包頭醫學院博士研究啟動基金項目（BSJJ201630）； 內蒙古自治區草原英才工程青年創新人才培養計劃項目（Q2017089）； 包頭市青年創新人才項目（包人社辦字〔2017〕284號）；包頭醫學院創新團隊發展計劃（BTMCTD202205）

Ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. inhibits hepatocyte apoptosis in rats with alcoholic liver disease by regulating mitochondria-cytochrome c

BAO Yanhong1a， WANG Qiang1b， ZHANG Wenlong2， GE Na3， LI Nan3， SU Jun4， LI Kexin3. （1. a. Institute of Health， b.Institute of Basis and Forensic Medicine， Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia 014040， China; 2. The First Affiliated Hospital， Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia 014010， China; 3. Institute of Nutrition and Food Health， Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia 014040， China; 4. System Reforms Office， Inner Mongolia Health Committee， Hohhot 010030， China）

Corresponding authors：

GE Na， genanihao80@163.com （ORCID：0000-0002-1512-1185）; LI Nan， 383541607@qq.com （ORCID：0000-0001-6635-7393）

Abstract：

Objective To investigate the inhibitory effect of ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. on hepatocyte apoptosis in rats with alcoholic liver disease based on the mitochondria-cytochrome c pathway. Methods A total of 50 specific pathogen-free male Wistar rats were divided into normal control group， alcohol model group， and low-， middle-， and high-dose ursolic acid groups using a random number table， with 10 rats in each group. The rats in the normal control group were given normal saline by gavage once a day for 8 weeks; the rats in the alcohol model group were given alcohol at increasing concentrations by gavage for 8 consecutive weeks; the rats in the low-， middle-， and high-dose ursolic acid groups were given ursolic acid at a dose of 50， 100， and 150 mg/kg， respectively， followed by an equal volume of alcohol as the model group 1 hour later. Serum liver function parameters were measured for each group; HE staining was used to observe liver histopathology; an electron microscope was used to observe hepatocyte ultrastructure; the TUNEL method was used to measure hepatocyte apoptosis; Western Blotting was used to measure the protein expression levels of cytochrome c and activated caspase-3 in hepatocyte mitochondria and cytoplasm. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the alcohol model group， the middle- and high-dose ursolic acid groups had significant reductions in the serum level of alanine aminotransferase， aspartate aminotransferase， and cholinesterase （all P＜0.05）. The rats in the alcohol model group had disordered arrangement of hepatic cords with marked hepatocyte edema and fatty degeneration， while those in the middle- and high-dose ursolic acid groups had basically normal arrangement of hepatic cords and a significant improvement in hepatocyte fatty degeneration， as well as a significant increase in the number of hepatocyte mitochondria and a significant improvement in morphology. Compared with the alcohol model group， the middle- and high-dose ursolic acid groups had significantly lower hepatocyte apoptosis rate and protein expression levels of cytochrome c and caspase-3 in cytoplasm （all P＜0.05）. Conclusion Ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. can improve the liver function and histomorphology of rats with alcoholic liver disease， possibly by inhibiting the release of cytochrome c in hepatocyte mitochondria， the activation of caspase-3， and the apoptosis of hepatocytes via the mitochondria-cytochrome c pathway.

Key words：Liver Diseases， Alcoholic;? ??? Hippophae Fructus; Apoptosis; Mitochondria; ??? ?Cytochromes c

Research funding：

National Natural Science Foundation of China（81550044， 81760586）； Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region（2014MS0303）； The Program for Young Talents of Science and Technology in Universities of the Inner Mongolia Autonomous Region（NJTY-15-B11）； Scientific Research Project on Health and Family Planning in Inner Mongolia Autonomous Region（201701084）； The Doctoral Research Foundation Project of Baotou Medical College（BSJJ201630）； Young Innovative Talents Training Program of Grassland Talents Project in Inner Mongolia Autonomous Region（Q2017089）； Baotou Youth Innovative Talent Project（2017-284）；Innovation Team Development Plan of Baotou Medical College（BTMCTD202205）

沙棘（hippophae rhamnoides），蒙名其察日嘎納，又名酸刺、黑刺、醋柳，為胡頹子科沙棘屬植物。含有黃酮類、類胡蘿卜素、甾醇類、生育酚、脂類等多種化合物，具有抗菌、消炎、調節血壓、抗氧化、抗癌等多種作用，是珍貴的藥食兩用植物［1］。研究［2］表明沙棘提取物對丙烯酰胺相關腦損傷具有保護作用，可用于治療心肌缺血［3］，已廣泛用于抗氧化、抗炎、抗菌、促進傷口愈合等皮膚病領域［4］，還可改善飲食引起肥胖中的脂肪沉積、肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥［5］。熊果酸（ursolic acid， UA）是一種五環三萜類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌等生物活性［6-9］，通過降低肝臟和血漿中甘油三酯、膽固醇水平，降低脂質積累，增加脂肪分解降低血脂，改善血液流變學、血流動力學，對動脈粥樣硬化起到一定的防治作用［10-11］，UA可通過抑制NOX4/NLRP3炎癥小體通路和細菌失衡逆轉肝纖維化，通過抑制胱天蛋白酶3減少肝細胞凋亡并減輕酒精誘導的肝損傷［12-13］，對化學性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷以及實驗性肝癌具有保護作用［14］，同時具備安全有效、毒性低的特性。

酒精性肝病（ALD）又稱酒精性肝損傷，是指長期大量飲酒所致的肝損傷，也是導致肝癌甚至急性肝衰竭最常見的誘因之一，嚴重危害著人類的健康［15］。既往研究［16-18］多集中在沙棘中黃酮的含量測定及生物學效應，對沙棘UA的研究報道較少，而關于酒精性肝損傷和UA的研究報道更少，且僅停留在檢測氧化應激指標來推測UA的保護作用可能與其抗氧化活性和抑制氧化應激有關。

本次研究通過分析沙棘UA對ALD大鼠肝功能生化指標、肝組織病理改變、肝細胞超微結構、肝細胞凋亡、內源性凋亡通路關鍵蛋白——細胞色素c及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）3表達的影響，從線粒體-細胞色素c途徑探討沙棘UA抑制ALD大鼠肝細胞凋亡的作用及其機制，為進一步開發沙棘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2月齡體質量為180～200 g的SPF級雄性Wistar大鼠50只，動物生產許可證編號：SCXK（魯）20140001，由山東魯抗醫藥股份有限公司提供。大鼠在室溫（23±2） ℃、50%～60%相對濕度、12 h光照條件下飼養。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 沙棘果采集于呼和浩特市和林縣境內野生沙棘林，由內蒙古農業大學提供并鑒定，后經內蒙古科技大學分離純化，并應用IR、1H-NMR和13C-NMR鑒定為五環三萜類化合物——UA，分子式為C30H48O3，分子量為456.68，純度93.8%。

1.2.2 試劑 ALT（C009-1-1）、AST（C010-1-1）和膽堿酯酶（ChE）試劑盒（A023-1-1）（南京建成生物工程研究所）；原位缺口粒端標記（TUNEL）法試劑盒（4500-0121）（美國Calbiochem公司）；細胞色素c（CST4272）和VDAC（CST4866）蛋白兔抗多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；活化caspase-3（BS7004）兔抗多克隆抗體（美國BIoworld公司）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（G2003）、RIPA裂解液（G2033-100），BCA蛋白濃度測定試劑盒（G2026）、小鼠抗GAPDH多克隆抗體（GB12002）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（GB23303）均購于武漢谷歌生物科技；SDS（S8010）、Tris（T8060）、甘氨酸（G8200）、Tween20（P1001）均購于北京索來寶公司；氯化鈉（10019318）、乙醇（10009164）購于北京國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備 ELx808型酶標儀（美國BioTek公司），JEM-1200EX透射電鏡（日本JEOL公司），半自動組織包埋機（英國SHANDON公司），RM2135型石蠟切片機（德國LEICA公司），752-P紫外分光光度計（上海現科儀器有限公司），TRANS-BLOT SD電轉膜儀（美國Bio-Rad公司），DYY-60型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4 動物分組及模型建立 適應性喂養SPF級雄性Wistar大鼠1周后，根據隨機數字表進行完全隨機分組，分為正常對照組、酒精模型組、沙棘UA低、中和高劑量組，每組10只。正常對照組給予每日1次生理鹽水灌胃8周；酒精模型組給予體積分數50%酒精8 mL·kg-1·d-1灌胃2周、12 mL·kg-1·d-1灌胃6周；UA低、中、高劑量組按50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、150 mg·kg-1·d-1分別給予沙棘UA進行灌胃，1 h后再灌模型組同等劑量酒精。大鼠每日自由進食，進水。

1.5 標本取材 末次灌胃后，禁食12 h，將Wistar大鼠稱重后給予2%戊巴比妥（0.3 mL/100 g）進行腹腔麻醉，自腹主動脈取血后，分離全血用于生化指標的檢測。一部分新鮮肝臟用于肝細胞超微結構分析，另一部分用于TUNEL法檢測，剩余樣本經液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 實驗觀察與指標測定

1.6.1 血清肝功能酶學指標測定 賴氏法檢測ALT和AST；微量酶標法檢測ChE，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.6.2 肝組織病理情況觀察 取0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm 新鮮肝組織放置于10%甲醛中進行固定，用石蠟包埋，切片，經HE染色，用中性樹膠封片，通過光學顯微鏡觀察各組大鼠肝組織形態結構。

1.6.3 肝細胞超微結構觀察 將各組相同部位肝組織1 mm3固定于2.5%戊二醛溶液中，后經脫水、包埋、切片、染色后，通過透射電鏡觀察肝細胞的超微結構。

1.6.4 肝細胞凋亡檢測 應用原位脫氧核苷酸末端轉移酶介導的TUNEL法檢測大鼠肝細胞凋亡情況。將肝組織用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片。將石蠟切片常規脫蠟、水化。按照TUNEL試劑盒的產品說明書操作，經DAB顯色，用中性樹脂封片，在光鏡下觀察TUNEL陽性細胞（即肝組織中呈黃色或棕黃色顆粒沉淀物）的數目、染色強度和密集區域的位置。每片計數500個細胞，并按公式：凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%，計算肝細胞凋亡率。

1.6.5 肝組織細胞色素c和活化casepase-3蛋白檢測 用Western Blot法檢測肝組織線粒體和胞漿細胞色素c蛋白表達水平和活化caspase-3蛋白表達水平。稱取各組同一部位肝臟，制成4 ℃勻漿，12 000 g離心20 min后取上清液，用BCA法進行蛋白定量。經SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入一抗，4 ℃孵育過夜，再洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，后經ECL化學發光試劑盒進行曝光，將定影后膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值［19］。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白/內參蛋白的光密度。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對檢測結果進行分析處理。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沙棘UA對ALD大鼠肝功能的影響 與正常對照組比較，酒精模型組大鼠血清ALT、AST和ChE水平均升高（P值均＜0.05）；而UA中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和ChE水平明顯低于酒精模型組（P值均＜0.05）；且UA中、高劑量組大鼠血清ALT、AST水平低于低劑量組（P值均＜0.05）（表1）。

2.2 沙棘UA對ALD大鼠肝組織病理改變的影響 肝組織HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞核圓、輪廓完整，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀分布; 酒精模型組大鼠肝細胞索排列紊亂，肝細胞水腫、脂肪變性明顯，可見肝細胞呈現片狀壞死和炎細胞浸潤; UA低劑量組水腫和脂肪變性的肝細胞減少，肝細胞索排列有所改善但仍紊亂，伴有炎癥細胞浸潤和點片狀壞死；UA中、高劑量組肝細胞索排列逐漸趨于正常，肝脂肪變性明顯改善（圖1）。

2.3 沙棘UA對ALD大鼠肝細胞超微結構的影響 如圖2所示，正常對照組大鼠肝細胞核核圓，核膜光滑，粗面內質網、線粒體數量較多，線粒體內嵴結構清晰，粗面內質網排列整齊，其上分布著豐富的核糖體；酒精模型組大鼠肝細胞體積變小，核不圓，線粒體數量減少，內嵴結構模糊，并出現萎縮、變形等改變，脂滴增多，膠原纖維增多呈纖維化改變；與酒精模型組相比，UA中、高劑量組，線粒體數目增加，粗面內質網排列較整齊，胞漿脂滴數量有所減少。

2.4 沙棘UA對ALD大鼠肝細胞凋亡的影響 HE染色結果顯示，正常對照組僅有少量凋亡細胞，酒精模型組和UA各劑量組大鼠肝凋亡細胞明顯多于正常對照組，凋亡率升高（P值均＜0.05）；而UA干預組肝細胞凋亡數量低于酒精模型組，凋亡率明顯下降（P值均＜0.05）。UA高劑量組凋亡率明顯低于低劑量組，且具有統計學差異（P＜0.05）（圖3、4）。

2.5 沙棘UA對ALD大鼠肝臟線粒體和胞漿細胞色素c蛋白表達的影響 Western Blot實驗結果顯示，與正常對照組比，酒精模型組大鼠肝細胞線粒體細胞色素c蛋白表達下降，胞漿細胞色素c蛋白表達增加（P值均＜0.05）；中、高劑量UA明顯抑制了酒精誘導的大鼠肝臟胞漿細胞色素c蛋白表達增多，緩解了線粒體細胞色素c蛋白表達下降（P值均＜0.05）；UA低劑量組與酒精模型組相比無統計學差異（P值均＞0.05）（圖5）。

2.6 沙棘UA對ALD大鼠肝臟活化caspase-3蛋白表達的影響 如圖6所示，酒精模型組與正常對照組比較，活化caspase-3蛋白表達程度升高（P＜0.05）；給予沙棘UA對酒精誘導下大鼠肝臟活化caspase-3表達增加有抑制作用，尤其UA中、高劑量組活化caspase-3蛋白的含量與酒精模型組比較顯著下降（P值均＜0.05），而UA低劑量組與酒精模型組相比差異不明顯（P＞0.05）。

3 討論

細胞凋亡是基因水平調控下的程序性死亡，是主動性死亡過程。生理條件下，可通過凋亡將老化和受損的肝細胞和機體其他細胞清除體外，以保證內環境的平衡，而病理條件可導致一些疾病的發生，如肝臟和腎臟的損傷、癌癥的發生、神經功能減退等。因此研究凋亡的發生機制及其影響因素和信號傳導對一些疾病的防治尤為重要。

近些年來，我國已經成為“全球第二酒精飲用國”［20］，隨著我國酒精人均消費量的增高，酒精已成為導致肝損害的第二大病因，僅次于肝炎病毒感染［21］。有調查［22］表明，北京市通州區常住居民ALD檢出率3.88%。延華等［23］對西北地區（陜西、甘肅、新疆）18歲以上的部分城市不同職業人群進行調查發現，ALD患病率高達8.7%。因此，探尋天然、安全且有效的預防

和治療酒精性肝損傷的功能性食品或藥物具有重要意義［24］。

盡管已有很多關于酒精對肝損傷的報道，但具體機制尚不清楚［25］。有研究［26-28］表明，ALD的發病機制與內毒素介導的細胞因子釋放、線粒體損傷、肝細胞凋亡、氧化應激、肝細胞損傷以及腸道微生物等密切相關。而肝細胞凋亡是乙醇誘導肝損傷的主要機制之一［29］。大量研究表明長期慢性飲酒可導致肝細胞凋亡［30-31］，并且細胞凋亡數目與疾病嚴重程度直接相關［32］。酒精的主要成分乙醇在肝臟代謝成乙醛的過程中，繼發引起氧化應激、內質網應激，致使線粒體結構受損、功能破壞，誘發內源性凋亡信號通路活化，導致肝細胞凋亡的發生［27，33］。多細胞生

物發生凋亡主要受線粒體損傷介導的內源性凋亡通路調控，即在一些凋亡刺激信號作用下，線粒體轉運孔的孔徑增大，使得線粒體的外膜被破壞，將本來存在于線粒體內的細胞色素c蛋白釋放到胞漿當中，從而激

酒精在體內主要是通過肝臟進行代謝，因此肝臟也成為其攻擊的靶器官［37-38］。血清轉氨酶和ChE是臨床上常用的肝功能評價指標，其水平的高低可以

反映肝細胞的損傷程度［39-40］。ALT和ALP主要存在于肝細胞的胞漿中，而AST主要存在于肝細胞的線粒體中，ALT活性升高，提示肝細胞破壞或膜通透性增強，而AST活性增強則提示線粒體也受損［41］。本實驗研究發現，酒精模型組大鼠血清中ALT、AST、ChE水平顯著上升，說明酒精既可造成肝細胞膜損傷，還可引起線粒體的損傷。而UA中、高劑量組可有效抑制酒精誘導性肝損傷大鼠的血清ALT、AST、ChE的水平升高，說明UA具有一定的肝臟保護作用，可有效避免酒精引起的肝臟細胞膜和線粒體的損傷。超微電鏡觀察還發現酒精干預后大鼠肝細胞的線粒體數量減少、結構改變以及大量膠原纖維堆積，光鏡下還看到大量的肝細胞發生凋亡，說明酒精可以導致大鼠肝細胞凋亡引起肝臟受損。有研究者［32，42］在ALD患者肝臟中也觀察到了凋亡細胞，并且發現凋亡細胞數目與疾病嚴重程度相關。而UA干預組（尤其是UA中、高劑量組）大鼠肝細胞線粒體病變減輕、數目有所增加，粗面內質網排列紊亂程度有所改善，胞漿脂滴數量有所減少，且肝細胞凋亡數目明顯減少，多為早期凋亡細胞。由此可證實，酒精可對肝細胞的線粒體造成損傷引起肝細胞凋亡，從而影響其功能，這與Xu等［43］發現大鼠攝入乙醇，隨時間延長，肝細胞線粒體腫脹和內質網退化程度不斷加重的研究結果相一致。而中、高劑量的UA可通過增加線粒體數目減輕酒精對大鼠肝細胞的損傷程度，這也表明了UA對酒精性肝損傷具有明顯的改善作用。

Western Blot實驗結果顯示，酒精模型組大鼠肝細胞胞漿細胞色素c蛋白表達明顯增加，而線粒體細胞色素c蛋白表達明顯下降，說明酒精可使肝細胞線粒體中的細胞色素c釋放到胞漿中，促進凋亡的發生；UA中、高劑量組肝細胞胞漿細胞色素c蛋白表達受抑制，而線粒體細胞色素c蛋白明顯增加，說明中、高劑量UA抑制線粒體的細胞色素c蛋白釋放到胞質當中，增加線粒體細胞色素c蛋白含量。caspase-3在caspase家族中處于凋亡級聯反應執行者的核心地位，是細胞凋亡途徑下游進行底物酶解的關鍵性蛋白酶，也是是多條細胞凋亡信號通路的中心蛋白，常被稱為“死亡蛋白酶”［44］。caspase-3在一般情況下以無活性的酶原（Pro-caspase） 形式存在，當肝細胞凋亡程序被激活時，Pro-caspase將轉變為有活性的裂解caspase-3，其可促進肝細胞的凋亡過程［45］，所以，活化的caspase-3常被用作判斷肝細胞凋亡的重要指標之一。本實驗實驗結果顯示，酒精模型組大鼠肝臟caspase-3活化增加，而UA干預組可抑制因酒精損傷引起的caspase-3的活化。說明UA可通過減少線粒體的細胞色素c蛋白的釋放和抑制caspase-3的激活，從而阻斷線粒體介導的內源性凋亡通路的激活，抑制肝細胞凋亡。

綜上所述，沙棘UA對酒精性肝損傷大鼠具有保護性作用，其機制可能是通過線粒體-細胞色素c途徑調控肝細胞凋亡而實現的，本研究結果為更深入探究酒精性肝損傷的發生機制，開發防治酒精性肝損傷的功能性食品/藥品提供了基礎的理論和實驗依據。

倫理學聲明：本研究于2016年12月20日經由包頭醫學院醫學倫理審查委員會審批，審批號：包醫倫審 2016 第（015）號。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：戈娜、李楠、李可欣等負責課題設計，資料分析；張文龍、王強、蘇軍等參與收集數據，修改論文；戈娜、包艷紅負責擬定寫作思路，撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：

2022-11-01；錄用日期：2022-12-26

本文編輯：王亞南

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