丁型肝炎流行病學(xué)篩查檢測(cè)指標(biāo)及適宜人群

遲秀梅 牛俊奇

摘要：HDV感染需要借助HBV的參與，感染后會(huì)加速疾病的進(jìn)展，具有很高的發(fā)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)全社會(huì)對(duì)丁型肝炎的認(rèn)識(shí)逐漸增強(qiáng)，一些針對(duì)丁型肝炎的治療藥物也成為研究的熱點(diǎn)，伴隨著臨床檢驗(yàn)手段的逐步完善，對(duì)于丁型肝炎的流行病學(xué)調(diào)查開(kāi)始被研究者重視。針對(duì)國(guó)內(nèi)HDV感染的具體情況雖已有多項(xiàng)研究，但由于研究隊(duì)列小、區(qū)域性強(qiáng)而數(shù)據(jù)偏差較大。本文就目前丁型肝炎流行病學(xué)調(diào)查中的調(diào)查人群及調(diào)查方法檢測(cè)指標(biāo)等進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，并對(duì)其中的關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行討論，以期未來(lái)獲取更準(zhǔn)確的流行病學(xué)資料，能夠更有效地篩查HDV感染者，為臨床早期的干預(yù)和治療提供幫助。

關(guān)鍵詞：δ肝炎病毒; 流行病學(xué); 診斷技術(shù)和方法

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81970519）；?? 吉林省自然科學(xué)基金（YDZJ202201ZYTS016）

Epidemiological screening and detection indicators for hepatitis D and suitable populations

CHI Xiumei1， NIU Junqi2. （1. Gene Therapy Laboratory， Center of Infectious Diseases and Pathogen Biology， The First Hospital of Jilin University， Changchun 130061， China; 2. Department of Hepatology， Center of Infectious Diseases and Pathogen Biology， The First Hospital of Jilin University， Changchun 130021， China）

Corresponding author：NIU Junqi， junqiniu@jlu.edu.cn （ORCID：0000-0001-5415-2024）

Abstract：

Hepatitis D virus （HDV） infection requires the participation of hepatitis B virus （HBV）， which accelerates disease progression after infection and induces a high risk of progression to end-stage liver diseases such as liver cirrhosis and liver cancer. With the gradual increase in the understanding of hepatitis D in the whole society， some therapeutic drugs for hepatitis D have become a research hotspot in recent years， and with the further improvement in clinical testing methods， researchers have started to pay attention to the epidemiological investigation of hepatitis D. Although many studies have been conducted for the specific situation of HDV infection in China， large data deviation is observed due to small cohorts with strong regional features. This article briefly reviews the population， methods， and indicators in the current epidemiological investigation of hepatitis D and discusses related key issues， in order to obtain more accurate epidemiological data， effectively screen out HDV infection， and provide help for early clinical intervention and treatment.

Key words：

Hepatitis Delta Virus; Epidemiology; Diagnostic Techniques and Procedures

Research funding：National Natural Science Foundation of China （81970519）; Natural Science Foundation of Jilin Province （YDZJ202201ZTYS016）

HDV是慢性丁型肝炎的致病因素，其可以與HBV同時(shí)感染，也可以繼發(fā)于慢性HBV感染之后，是病毒性肝炎最嚴(yán)重的形式［1］。2017年10月世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將HDV列入三類(lèi)致癌物清單。若能早期準(zhǔn)確地篩選未知的HDV感染者，并對(duì)丁型肝炎流行病學(xué)有準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，臨床工作者就可以盡早進(jìn)行干預(yù)，控制病情進(jìn)展，合理分配醫(yī)療資源，為提高患者生存質(zhì)量作出貢獻(xiàn)。本文就目前丁型肝炎流行病學(xué)調(diào)查中的檢測(cè)指標(biāo)和方法及調(diào)查人群等進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，提出部分問(wèn)題，僅供參考。

1 HDV生命周期

HDV是缺陷病毒，需要借助HBV來(lái)完成其生命周期。HDV的包膜蛋白正是HBV的包膜蛋白（HBsAg），HDV與HBV一樣需要借助于肝細(xì)胞表面的牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞漿中HDV的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物被釋放，形成HDV基因組和HDV抗原（HDAg）兩部分［2-3］。 HDV的基因組是環(huán)狀單鏈反義RNA（HDV RNA），有8種基因型（HDV1～HDV8），根據(jù)基因型的不同含有1 672～1 697個(gè)核苷酸［3-4］，各種分型之間的序列分化度最高是1型和3型［5］，可高達(dá)40%。基因組進(jìn)入到細(xì)胞核中首先生成反義基因組RNA（agRNA）和轉(zhuǎn)錄組mRNA，再進(jìn)行HDV RNA的復(fù)制和產(chǎn)生病毒抗原蛋白。在宿主腺苷脫氨酶1的作用下，agRNA被修飾，從而產(chǎn)出兩種不同的病毒抗原蛋白L-HDAg和S-HDAg［6-8］。這兩種蛋白連接到病毒基因組形成RNP，在細(xì)胞漿中利用HBsAg形成包膜，再由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體分泌至細(xì)胞外［9］，準(zhǔn)備進(jìn)行下一次的感染。

通過(guò)對(duì)HDV感染生命周期的分析可以看出參與HDV感染的兩個(gè)必要條件，即HBsAg的存在和HDV的入侵，是否存在HBV DNA可能并不重要。在該生命周期中有HDV RNA和HDAg。人體免疫細(xì)胞針對(duì)HDV將產(chǎn)生特異性的抗體，包括免疫球蛋白 M（IgM）抗體（抗HDV-IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗體（抗HDV-IgG），這些都將是HDV感染的檢測(cè)指標(biāo)。

2 HDV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)

我國(guó)在2009年6月實(shí)施《丁型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》（衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS300-2008）后至今還沒(méi)有正式的丁型肝炎診療指南。單純根據(jù)臨床表現(xiàn)特征進(jìn)行診斷不準(zhǔn)確，但是可以作為實(shí)驗(yàn)室診斷的線索：（1）HDV流行區(qū)內(nèi)HBsAg攜帶者發(fā)生肝炎。（2）急性乙型肝炎出現(xiàn)血清ALT和膽紅素波動(dòng)。（3）病情已趨穩(wěn)定的非活動(dòng)性肝炎患者突然出現(xiàn)活動(dòng)性肝炎，或慢性乙型肝炎病程中表現(xiàn)進(jìn)行性惡化。（4）HBV復(fù)制指標(biāo)已降低或消失而臨床表現(xiàn)反見(jiàn)惡化的病例。但是，美國(guó)肝病學(xué)會(huì)在2018年的乙型肝炎治療指南［10］中明確指出，關(guān)于HDV感染確診決定于HDV組織學(xué)或血清學(xué)標(biāo)志的檢測(cè)，必須有血清HDV RNA的檢出。組織學(xué)診斷：肝活檢標(biāo)本肝細(xì)胞核內(nèi)HDV（HDAg或HDV RNA）組織染色為陽(yáng)性。血清中抗HDV-IgM和抗HDV-IgG檢測(cè)陽(yáng)性可以初步判斷已有HDV感染，但仍需要進(jìn)一步檢測(cè)血清HDV RNA［10-12］，若確為陽(yáng)性才能診斷。

3 HDV篩查的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)

3.1 抗HDV-IgM/抗HDV-IgG檢測(cè) 目前，抗體檢測(cè)通常用作HDV感染的主要篩查手段。抗HDV-IgM可在癥狀發(fā)作后2～3周被檢測(cè)到，并在急性感染后2個(gè)月消失［2，13］，一般用于疾病的早期診斷。然而，慢性丁型肝炎患者在疾病發(fā)作期間抗HDV-IgM也會(huì)升高［14］，因此抗HDV-IgM的檢測(cè)不能明確區(qū)分急性和慢性HDV感染。當(dāng)慢性HDV感染或HDV重疊感染時(shí)，抗HDV-IgG是識(shí)別慢性丁型肝炎的主要標(biāo)志。抗HDV-IgG在HDV感染和慢性HDV感染急性緩解患者中均呈陽(yáng)性，并且在病毒清除后持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，雖然難以區(qū)分現(xiàn)癥和既往HDV感染，但仍是進(jìn)行丁型肝炎初篩時(shí)的必要指標(biāo)。鑒于抗HDV-IgM存在時(shí)間較短，而抗HDV-IgG在體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，因此在篩選過(guò)程中進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)建議采用抗HDV-IgG。

抗體檢測(cè)普遍公認(rèn)的方法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）。ELISA方法檢測(cè)HDV抗體時(shí)受到許多因素的影響：（1）急性HDV感染時(shí)，HDV抗體存在時(shí)間很短很難檢出，所以HDV抗體陰性不能否定丁型肝炎的發(fā)生；而慢性HDV感染時(shí)，血液中的HDV抗體和抗原形成免疫復(fù)合物，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。（2）通常使用間接法檢測(cè)抗HDV-IgG，但是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，不同廠家的試劑盒質(zhì)量參差不齊，抗HDV-IgG與肝細(xì)胞受損和炎癥活動(dòng)密切相關(guān)，因此只能作為臨床HDV感染的初步篩查，明確診斷還需要聯(lián)合血清HDV RNA的檢測(cè)結(jié)果才能確診。

由于抗體檢測(cè)手段有一定的局限性，很多研究者開(kāi)始探索更優(yōu)化的檢測(cè)方法。例如，目前ELISA試劑盒普遍使用酶催化底物的顯色反應(yīng)，存在靈敏度不高，特異度不強(qiáng)的缺點(diǎn)。對(duì)HDAg重新表達(dá)和純化，將其固定于固相載體，并且進(jìn)一步與納米酶顯色技術(shù)相結(jié)合，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。此外，抗HDV-IgG可以通過(guò)定量微陣列抗體捕獲（Q-MAC）方法進(jìn)行定量檢測(cè)，這種定量熒光檢測(cè)的方法大大提高了檢測(cè)的靈敏度［11，15］。德國(guó)海德堡大學(xué)Urban團(tuán)隊(duì)［16］開(kāi)發(fā)了一種試紙條式快速診斷HDV抗體的試劑。試劑開(kāi)發(fā)基于一種新型重組肝炎δ抗原，該抗原在所有已知的HDV基因型中具有泛基因型活性。該方法在474例患者樣本隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)與ELISA方法相比，其靈敏度為94.6%（314/332），特異度為100%（142/142）。因其快速的診斷和便捷的方法，可以預(yù)見(jiàn)該新型HDV快速檢測(cè)方法將成為流行病學(xué)研究和臨床診斷的重要工具，特別是在目前缺乏可靠HDV檢測(cè)的地區(qū)。

3.2 HDAg檢測(cè) HDAg存在于受感染的細(xì)胞內(nèi)和外周，出現(xiàn)比較早，但僅持續(xù)1～2周，由于檢測(cè)不及時(shí)，往往呈陰性反應(yīng)［17］。檢測(cè)血清HDAg，如為陽(yáng)性，有助于早期診斷。慢性HDV感染時(shí)，由于血清中抗HDV-IgG滴度高，HDAg多以免疫復(fù)合物形式存在，游離狀態(tài)的抗原保持在低滴度水平［17-18］。

血清中抗原檢測(cè)一般采用免疫酶法或放射免疫法。血清HDAg的檢出有限，在急性感染的前2周可檢測(cè)到［17］。放射免疫測(cè)定是以放射性核素為標(biāo)志物的標(biāo)記分析法，用于定量檢測(cè)受檢標(biāo)本中的抗原。這種檢測(cè)方法既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測(cè)量的高靈敏度，因此能精確測(cè)定各種具有免疫活性的極微量的物質(zhì)。但該檢測(cè)方法也不乏缺點(diǎn)，由于放射免疫分析是競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，測(cè)量值是相對(duì)量而非絕對(duì)量；另外存在放射線輻射和污染等問(wèn)題尚不能被廣泛應(yīng)用。肝內(nèi)HDAg可采用免疫熒光法或免疫組化技術(shù)檢測(cè)，能夠發(fā)現(xiàn)HDAg位于肝細(xì)胞核內(nèi)或位于肝細(xì)胞漿中，有利于診斷。也可應(yīng)用免疫印跡法分離HDAg，可檢測(cè)到HDAg-P24和HDAg-P27蛋白［19］，方法較為復(fù)雜。但以上方法在臨床應(yīng)用中較少，僅在研究性文章中有所描述。

3.3 HDV RNA檢測(cè) HDV RNA是當(dāng)前診斷HDV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”［20-21］，HDV RNA陽(yáng)性是HDV復(fù)制和HDV感染的直接證據(jù)。同時(shí)HDV RNA的定量測(cè)定也用于監(jiān)測(cè)抗病毒治療的應(yīng)答［22-25］。

檢測(cè)血清HDV RNA可用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）。RT-PCR方法是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)手段。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上增加信號(hào)系統(tǒng)，以達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的目的。根據(jù)信號(hào)的不同，可分為熒光染料法和探針?lè)ǎ?6］。目前，有許多商用試劑盒可用于定量測(cè)定HDV RNA。這些技術(shù)旨在靶向編碼HDAg或核酶結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域的序列。HDV基因組具有強(qiáng)大的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄步驟前加入熱休克處理來(lái)破壞［27］，從而提高逆轉(zhuǎn)錄效率。使用一步法RT-qPCR可降低逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增過(guò)程中的污染風(fēng)險(xiǎn)［28］。大多數(shù)已發(fā)表的研究［27-28］中使用的標(biāo)準(zhǔn)是HDV質(zhì)粒DNA，但這并不評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄步驟。其他研究使用體外合成的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)，雖然可以評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄步驟，但合成的RNA不具有很強(qiáng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，HDV基因組的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響病毒的定量［20］。目前RT-PCR檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到103拷貝/μL，巢式PCR檢測(cè)下限可以達(dá)到10拷貝/μL［21］。盡管RT-PCR檢測(cè)具有快速、方便、特異等優(yōu)點(diǎn)，但是HDV RNA中GC含量和互補(bǔ)性高，為HDV擴(kuò)增帶來(lái)了巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)，而且HDV的高度遺傳變異性也使得需要精心設(shè)計(jì)其引物和探針。由于HDV RNA的廣泛遺傳變異性，迄今為止尚無(wú)完全標(biāo)準(zhǔn)化的PCR檢測(cè)技術(shù)。不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果也不具有可比性。一項(xiàng)對(duì)全球12個(gè)國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的綜合分析［12］表明，由于檢測(cè)技術(shù)和程序的差異，以及引物或探針設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域不同，結(jié)果存在高度異質(zhì)性。因此，有必要建立國(guó)際上對(duì)HDV RNA進(jìn)行定量的檢測(cè)系統(tǒng)。

RT-qPCR檢測(cè)方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)完成。然而，仍需要開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法，不僅具有較高的靈敏度和特異度，而且可以監(jiān)測(cè)HDV RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量等一系列過(guò)程，從而降低假陰性率，更早地識(shí)別丁型肝炎患者，并及時(shí)控制HDV傳播。目前針對(duì)核酸檢測(cè)技術(shù)有了很多新的進(jìn)展。首先，基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)，建立了可以絕對(duì)定量丁型肝炎患者體內(nèi)HDV RNA水平的ddPCR技術(shù)檢測(cè)方法［20-21］，檢測(cè)下限可低至單個(gè)拷貝［20］。其次，使用最新的CRISPR/Cas13a檢測(cè)技術(shù)建立了對(duì)HDV RNA進(jìn)行精準(zhǔn)、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)下限分別低至10拷貝/μL和100拷貝/μL。相信經(jīng)過(guò)努力，未來(lái)研究成果可以投入HDV的臨床應(yīng)用檢測(cè)，更有利于HDV感染的早期篩查，為更多的臨床醫(yī)生和患者提供幫助。此外，還需要建立標(biāo)準(zhǔn)化程序，例如樣品類(lèi)型、提取方法、引物/探針設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)流程、使用儀器和檢測(cè)國(guó)際化單位的確定。因此，未來(lái)的目標(biāo)是將這一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化。新的方法如質(zhì)譜和實(shí)時(shí)生物傳感平臺(tái)［11］，可能也會(huì)應(yīng)用至對(duì)HDV RNA或其成分的監(jiān)測(cè)中。

4 HDV篩查人群

美國(guó)肝病學(xué)會(huì)建議僅對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行檢測(cè)，如HBV/HCV共感染者、HBV/HIV共感染者、乙型肝炎基礎(chǔ)上合并有靜脈吸毒者、高危險(xiǎn)性行為者等［10］，而歐洲肝病學(xué)會(huì)/亞太肝病學(xué)會(huì)則建議對(duì)所有HBsAg陽(yáng)性的肝病患者進(jìn)行HDV抗體檢測(cè)［29-30］。多項(xiàng)Meta數(shù)據(jù)分析及綜述［2，5，11-12，31］都對(duì)HDV的流行病學(xué)進(jìn)行了描述，但文中數(shù)據(jù)差距較大。Rizzetto等［31］分析指出，對(duì)HDV低風(fēng)險(xiǎn)無(wú)癥狀HBsAg攜帶者的調(diào)查并不能反映感染的真實(shí)狀況，更應(yīng)該關(guān)注重癥和終末期乙型肝炎患者的HDV合并感染的情況。經(jīng)Meta分析［5］顯示美國(guó)和歐洲的HBsAg陽(yáng)性患者中丁型肝炎患病率分別為2.6%和19.5%。最近的一項(xiàng)研究［32］結(jié)果顯示，在一個(gè)涉及1 556例的隊(duì)列中整體HDV感染率為15.2%，其中靜脈吸毒者HDV感染率為50.5%。由于北美地區(qū)與歐洲/亞太地區(qū)丁型肝炎感染率的差距明顯，因此美國(guó)肝病學(xué)會(huì)與歐洲肝病學(xué)會(huì)/亞太肝病學(xué)會(huì)的建議不一致。我國(guó)因HBV感染人群基數(shù)較大，對(duì)于重點(diǎn)人群應(yīng)做到應(yīng)檢盡檢，對(duì)于普通HBsAg陽(yáng)性人群則可以根據(jù)具體情況選擇性篩查。關(guān)于優(yōu)化篩選人群，可以參考患者已知的HBsAg定量和HBV定量?jī)身?xiàng)指標(biāo)確定是否有必要進(jìn)行丁型肝炎的篩查。本團(tuán)隊(duì)研究（未發(fā)表數(shù)據(jù)）吉林省共計(jì)5 594例乙型肝炎患者進(jìn)行抗HDV-IgG檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗HDV-IgG陽(yáng)性者中71%其HBsAg定量＞250 IU/mL，93%抗HDV-IgG陽(yáng)性患者的HBV DNA定量＜2 000 IU/mL。城鎮(zhèn)居民對(duì)于健康意識(shí)較強(qiáng)，可能會(huì)主動(dòng)進(jìn)行體檢或篩查。而對(duì)于很多農(nóng)村地區(qū)、醫(yī)療資源不足的地區(qū)以及體檢意識(shí)較弱的大眾群體，疾控部門(mén)應(yīng)該有組織地對(duì)這些人員進(jìn)行篩查。為了更有效地發(fā)現(xiàn)潛在的丁型肝炎患者，又能最大限度地節(jié)約資源，筆者建議篩查的主要對(duì)象應(yīng)該針對(duì)高危人群和已知的乙型肝炎患者（HBsAg＞250 IU/mL和/或HBV RNA＜2 000 IU/mL），做到應(yīng)檢盡檢。雖然這種篩查人員的選擇可能遺漏部分可能的HDV感染者，但是能夠更高效地利用醫(yī)療資源。此外，還可以根據(jù)個(gè)人意愿及臨床癥狀等隨時(shí)進(jìn)行丁型肝炎的檢測(cè)，做到愿檢盡檢，多方共同參與，盡可能完成完善的丁型肝炎篩查工作。

5 小結(jié)

綜上所述，結(jié)合我國(guó)目前的臨床和試劑檢測(cè)等各方面的條件，在既有效又節(jié)約資源的前提下，為進(jìn)一步了解HDV感染的總體情況，掌握基本可靠的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，除對(duì)重癥和終末期乙型肝炎患者及時(shí)進(jìn)行HDV檢測(cè)外，普通大眾可以僅對(duì)已知HBsAg＞250 IU/mL和/或HBV RNA＜2 000 IU/mL的患者，進(jìn)行抗HDV-IgG檢測(cè)。對(duì)于抗HDV-IgG陽(yáng)性者根據(jù)臨床表現(xiàn)和抗體檢測(cè)光密度值判斷是否有進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)確診的必要。丁型肝炎篩查流程總結(jié)見(jiàn)圖1。

圖1 丁型肝炎篩查流程圖

Figure 1 Hepatitis D screening flowchar

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：遲秀梅負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)，收集資料，撰寫(xiě)文稿；牛俊奇負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，修改審閱文稿及最后定稿。

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收稿日期：

2023-02-09；錄用日期：2023-03-09

本文編輯：葛俊