耐甲氧西林金葡菌的分子分型、毒力因子及生物膜研究

張麗心 于燕 常育 陳瑞琪

摘要：目的 研究耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的標本分布、耐藥情況、SCCmec、spa分型、相關毒力因子及生物膜形成情況。方法 采用多重PCR擴增SCCmec、spa基因及毒力因子（tst、lukE、pvl、fnbA、fnbB、cna、clfA、clfB）；采用Sanger雙脫氧鏈終止法對擴增產物測序；采用微孔結晶紫染色法研究菌株生物膜形成。結果 標本來源以分泌物最多，其次是痰；標本分布以兒童病區最多，其次為創傷病區及重癥監護病區；SCCmec分型顯示I型最多，占56%；spa分型以t437最多，占43%；多數菌株同時攜帶3種及以上毒力因子，以cna、fnbB和clfA黏附分子為主；60%的MRSA菌株具有較強生物膜形成能力。結論 MRSA在兒童病房的流行需要引起注意；ICU病區呼吸機引起的相關感染仍是一大難題。本醫療機構內MRSA（2018—2019年）菌株以t437-SCCmecI型為主要流行克隆株。MRSA攜帶黏附毒素比率高，容易形成生物被膜，成為治療的一大難題。

關鍵詞：耐甲氧西林金葡菌；SCCmec；spa；毒力因子；生物膜

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Abstract Objective To study the distribution， drug resistance， SCCmec or spa genotype， related virulence factors， and biofilm formations of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）. Methods Multiplex PCR was used to amplify SCCmec or spa genotype. Sanger dideoxy chain termination was used to sequence the amplified products. Bacterial biofilms were studied by the microporous crystal violet staining. Results The most common source of specimens was secretions， followed by sputum. Most of the specimens were distributed in childrens wards， followed by trauma wards and intensive care wards. SCCmecI was the most common type and accounted for 56% in MRSA; t437 was the majority in spa types， and accounted for 43%. Most strains carried three or more virulence factors at the same time， mainly cna， fnbB， and clfA adhesion molecules; 60% of MRSA strains had strong biofilm formation ability. Conclusion The prevalence of MRSA in childrens wards needs attention. The related infections caused by ventilator in ICU ward are still a major problem. The t437-SCCmec I strain is the main epidemic clone of MRSA （2018—2019） in our medical institution. MRSA carries a high rate of adhesion toxins and is easy to form biofilms， which has become a problem in treatment.

Key words Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; SCCmec; spa; Virulence factors; Biofilm formation

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是醫院內重要的臨床致病菌之一，由于對多種抗生素高水平耐藥，成為導致院內感染和社區感染的重要病原菌之一。根據全國細菌耐藥監測網（China antimicrobial resistance surveillance system， CARSS）監測結果顯示，2014—2019年我國醫療機構內MRSA的平均檢出率仍在30%左右[1]。因此，對醫療機構內的耐藥菌進行分析和有效的鑒定分型，研究耐藥菌的分子流行病學特征對醫療機構防控該菌傳播及耐藥研究具有重要意義；探討所研究區域的耐藥情況及臨床感染特征，對臨床準確診治感染，合理使用抗微生物藥物，減少和控制耐藥細菌的傳播具有重要意義。本實驗收集我院2018年6月—2019年7月住院患者治療期間血液、痰液及傷口分泌物培養出的MRSA菌株（同一患者多次標本的菌株，均取首次），所有菌株經梅里埃公司VITEK 2-compact微生物自動化系統鑒定，并進行藥敏實驗后，-80℃磁珠凍存。對所留取菌株進行SCCmec、spa基因、相關毒力因子擴增及生物膜形成實驗，分析本單位MRSA的流行情況及主要基因分型，以期更好地為臨床抗感染治療及醫院感染防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集本院2018年6月—2019年7月的臨床MRSA 菌株，依次編號后用平板劃線法提純，用磁珠保存并標記提純后的細菌于-80℃，并登記相應患者的醫療信息。

1.1.2 主要試劑與儀器

全自動細菌鑒定藥敏分析儀（法國Biomerieux VIEK-2 Compact）；PCR擴增儀Bio-Rad C1000 （美國Bio-Rad）；DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀（中號） （北京六一生物科技）；Alpha凝膠成像系統 AlphaImager HP （美國ProteinSimple）；Trans2K? DNA Marker （BM101-01， TRAN）；基因克隆試劑2×EasyTaq? PCR SuperMix （+dye ）（AS111-11， TRAN）；Agarose Regular （TaKaRa，5260）；StarStain Red核酸染料10000×（GenStar， E109-01）；膠回收試劑盒DP209（天根生物）；DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）（美國Axygen）。

DNA分子量標準Trans2K? DNA Marker （BM101-01， TRAN）（北京全式金生物技術）。

1.2 方法

1.2.1 MRSA的檢測

（1）細菌濁度：挑取在合適培養基上分離到的革蘭染色為陽性球菌的待測菌落于0.85%NaCl溶液中，配制濃度為0.50至0.63 CFU/mL標準單位的菌懸液。

（2）上機鑒定：用革蘭陽性細菌鑒定卡（GP鑒定卡）進行菌種鑒定。

（3）結果判讀：根據觀察到的多個生長特征參數計算MIC值。

1.2.2 SCCmec分型

參照文獻方法[2]，采用多重PCR法對MRSA菌株進行SCCmec基因分型。SCCmec基因分型所需的九對引物序列見文獻[2]。

Multiplex PCR反應體系（50 μL：Multi酶系Mix 8.5 μL，Multi Buffer Mix 25 μL，Solution II 0.25 μL，DNA 1 μL，上游、下游引物（共8對引物）各0.5 μL，RNase Free-H2O補至終體積25 μL。

反應條件：95℃預變性 15 min，30個循環（94℃變性30 s，57℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min），72℃延伸10 min，4℃保持。

PCR反應結束后，將產物置于4℃冰箱，取5 ?L產物加入1%瓊脂糖凝膠中，120 V電泳30 min，用凝膠成像儀觀察實驗結果，比對分析出現的電泳條帶，根據條帶位置，參照Marker， 確定其SCCmec可能型別。隨機選取PCR擴增的陽性產物送公司進行測序分析，確認條帶的準確性及特異性。

1.2.3 spa分型及測序

spa基因的X區由多個24 bp片段大小重復區構成，重復2～16次，通過對該區域重復序列的個數和排列的差異進行菌株分型，檢測快速、分辨率高、分型能力強、結果命名易于標準化。該區域根據參考文獻設計擴增引物[3]：

反應體系和循環參數同SCCmec分型，擴增的產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳25 min后拍照保存，外送測序公司進行雙向測序。

測序結果統一提交網站http：//spatyper.fortinbras，.us/分析確定型別。測序公司：楊凌天潤奧科生物科技有限公司；測序方法：Sanger雙脫氧鏈終止法。

1.2.4 毒力因子擴增

根據文獻報道[4-5]，采用PCR法擴增相關毒素基因。包括毒素基因tst、lukE、pvl和黏附基因fnbA、 fnbB、cna、clfA、clfB，同時通過比較不同克隆間毒力因子攜帶率的差異，探索各流行克隆菌株可能的毒力特征。

PCR反應體系及反應條件同SCCmec分型部分。隨機選擇PCR擴增陽性產物送公司進行測序分析，確認條帶的準確性和特異性。

1.2.5 生物膜形成情況

根據文獻[6]，運用結晶紫法，對全部菌株進行染色，觀察生物膜形成情況。每株菌設3個復孔，每種菌株A值取4個孔的實驗平均值（A值），空白組只加入含1%葡萄糖的TSB溶液，空白組A值的2倍作為界限值（Ac）。根據每組細菌A值與Ac值大小的關系，細菌被分為以下4類[7]：①強生物被膜形成株（A＞4×Ac）；②較強生物被膜形成株（2×Ac＜A≤4×Ac）；③弱生物被膜形成株（Ac＜A≤2×Ac）; ④無生物被膜形成株（A≤Ac）。

2 結果

2.1 標本來源及臨床分布特點

共留取本醫療機構2018年6月—2019年7月經檢驗科微生物室細菌培養結果回報為MRSA的菌株共70株（同一患者多次重復分離株標本只計入首次），結果見附表1。

2.2 耐藥分析

研究所留取的MRSA菌株均為頭孢西丁篩選實驗（+），苯唑西林耐藥（≥4），其余藥物體外藥敏實驗結果顯示：青霉素100%耐藥率，克林霉素69%耐藥率，值得注意的是莫西沙星耐藥率達到30%，萬古霉素、利奈唑胺、達托霉素均未發現有耐藥菌株，結果見表2。

2.3 SCCmec分型結果

本次研究檢測的70株MRSA中69株擴增出mecA基因陽性，陽性率98.5%。mecA基因條帶與DNA marker比較，位置相符，無非特異性產物條帶。擴增產物經測序證實為mecA基因。

結果提示（表3）：SCCmecI型占56%，SCCmecIII和SCCmecIVc各占8.5%，有16株未顯示分型，占23%；對分型結果行隨機測序顯示結果相符。提示本醫療機構內SCCmecI型為主要流行株。PCR電泳結果（圖1）。

2.4 spa分型結果

對70株MRSA 菌株均進行擴增，然后將產物全部測序，結果顯示（表4）以t437型最多，占43%，其次為t030型，占13%。結合2種分型方法，在本醫療機構中以t437-SCCmecI菌株為主要流行克隆株。PCR電泳結果（圖2）。

2.5 毒力因子擴增結果

對70株MRSA菌株毒素基因tst、lukE、pvl和黏附基因 fnbA、fnbB、cna、clfA、clfB，同時進行PCR擴增， 隨機挑取擴增產物進行測序比對。結果顯示（表5），60%以上的菌株含有3個及其以上的毒力因子。攜帶率高的毒力因子基因分別為cna（76%）、clfA（73%）、fnbB（49%）和fnbA（27%）。結果提示黏附毒素攜帶率較高，而細胞毒素lukE和pvl及超抗原tst均比較低。PCR電泳結果（圖3）。

2.6 生物被膜形成情況

結果發現（表6～7），70株MRSA菌株中有較強生物被膜形成的有42株，占所有菌株的60%，且發現均攜帶有cna、clfA和fnbB，3種毒力因子。無生物被膜形成菌株中有2株未攜帶毒力因子，1株攜帶cna。

生物被膜形成株細菌 A值與空白組相比，有顯著差異（表7）。

3 討論

2019年CLSI M100重新修訂了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的定義，指由mecA和mecC基因表達或具其他耐甲氧西林機制的金黃色葡萄球菌菌株。大多數的葡萄球菌分離株，苯唑西林耐藥是由mecA基因介導，編碼青霉素結合蛋白2a，非mecA基因介導的苯唑西林耐藥機制很罕見，包括有變異的mecA同源基因和mecC基因[8]。

在抗生素存在下，SCCmec上的mecA基因可作為誘導劑分解結合在其啟動子上的阻遏蛋白mec I， 啟動mecA表達，產生PBP2a，繼續肽聚糖的合成，從而使細菌產生耐藥[9]。本實驗中70株MRSA菌株經PCR擴增出mecA目的基因條帶69株，陽性率98.5%，未擴增出目的基因的菌株，可能與菌株不純有關。

根據目前已知的mec復合體、ccr復合體的相互結合類型及J區的亞類型別，SCCmec可被分為I型～XIII型共13個類型[10-11]。人源MRSA主要攜帶I-VIII型SCCmec元件，其中I-V型多見，醫院獲得型MRSA（HA-MRSA）分離菌株以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型多見；社區獲得型MRSA（CA-MRSA）以IV型、V 型多見[12]。在本研究中，70株MRSA除16株未顯示SCCmec分型外，其余54株菌株中56%為SCCmecI型，5株分別為SCCmecIII型和SCCmecIVc型，結果提示，在所研究階段本醫療機構內以SCCmecI型為主要流行克隆株。

本醫療機構6年（2015—2020年）的數據統計結果顯示，MRSA的平均檢出率占所分離出金葡菌的38.6%，高于本省及全國平均檢出率。標本來源以分泌物最多，占全部留取MRSA菌株的64%，與本醫療機構骨科床位數及骨科患者占比多有關。標本分布病區以手外修復骨科最多，占21%，與患者多為開放損傷，多次手術且住院時間長有關；值得注意的是，小兒骨科病區送檢標本也居于前列，占14%，僅次于開放性損傷較多的創傷骨科病區，提示我們MRSA在兒童病房的流行不容忽視；ICU病區送檢均為痰標本，提示在ICU病區呼吸機引起的相關感染仍是一個棘手的問題。

院內多重耐藥菌的定植是臨床感染的主要原因之一。住院患者耐藥菌一般不外乎以下途徑：①社區感染進入；②正常菌群在人體某部位定植。而住院期間經有創檢查，侵入性治療，及自身免疫力低下等原因，細菌移行誘發感染；有部分患者因外傷或局部傷口等因素，在相對密閉的病房環境中，可能接觸環境物品中定植菌或通過與攜帶定植菌的醫護人員接觸而引起耐藥菌轉移誘發感染[13]；還有部分患者因傷住院時間較長，由于正常皮膚定植菌在易感因素誘發下引起感染，及抗微生物藥物使用不當，在抗生素篩選壓力下，導致耐藥菌繁殖生長等。此外還有一些其他因素如年齡，基礎疾病等均可導致醫院內耐藥菌感染。

根據CHINET的報告，雖然MRSA的檢出率在下降，但在來源于兒童的標本中，MRSA檢出率卻呈上升趨勢[14]。2019年全國細菌耐藥監測報告數據顯示：全國兒童醫院（含婦幼保健院） CTX/CRO-R-KPN、CR-ECO、CR-KPN 、MRSA、MRCNS及ERSP的檢出率高于三級醫院及二級醫院。本研究中，從標本分布病區情況看，兒童病區樣本量處于第三位，結合文獻報道[15]， 結果提示對MRSA在兒童病房的流行在醫療機構內部需加強監護，同時對兒童感染的用藥建議進行專項監控，避免不合理使用導致耐藥菌大幅增長。

spa分型由特異性蛋白A編碼的spa基因提供合適的短重復序列區域作為單基因座序列分型的靶點，具有多態性[16]。本研究發現，在本醫療機構內MRSA菌株以t437型最多，占43%，其次為t030型，占13%。

兩種分型方法的結果顯示t437-SCCmecI型為本研究中主要的MRSA流行克隆株，提示醫療機構內部的感染控制仍不容輕視。醫務人員自身防護、無菌操作規范化意識仍需不斷提高和加強；醫務人員手消毒、無菌操作、環境監測等方面的嚴格要求并實施，對于SAU及MRSA的防控極為重要。同時，兒童病區MRSA的流行建議進行動態監控，并追蹤分析原因。

生長繁殖期的金葡菌產生多種致病因子，在指數生長初期產生細胞表面因子，其中的黏附因子在細菌感染中起重要作用，促使細菌定植，并逃避宿主免疫系統的攻擊。本研究對MRSA的幾種黏附因子進行研究，發現識別血纖維蛋白原的黏附素clfA，識別膠原的黏附素cna及識別纖維黏連素的黏附素fnbB攜帶率最高。 通過微孔法結晶紫染色對菌株生物膜形成進行研究，發現同時攜帶cna、clfA和fnbB3種毒力黏附因子的MRSA菌株具有較強的生物被膜形成能力，占所研究菌株的60%，這一結果也和64%的標本類型為分泌物相一致，在研究中大部分標本來源于骨科病區患者的傷口分泌物，因為骨科手術內固定物的存在，加上傷口周圍血液、細胞外基質等的包裹，為細菌的黏附提供了很便利的條件，通過特異性和非特異性結合，細菌很容易聚集在一起，形成生物膜，生物膜的存在提高了細菌對抗菌藥物的耐藥性，增加了細菌的多重耐藥機制，增加了臨床治療的困難。同時由于細菌形成生物膜的能力在各菌株間表現不同，因此有必要對不同來源菌株的生物膜形成能力進行評估和測定，以便更好的采取必要措施進行預防和治療。建議對來自于傷口分泌物的骨科手術標本，采取簡便的實驗進行生物膜評估，可以采用多重PCR的方法擴增細菌黏附因子來對生物膜形成進行快速的初步預測，有利于臨床合理使用抗菌藥物，提高治愈率，縮短治療時間。進一步，針對MRSA黏附因子作為靶點進行藥物研究，減少定植黏附，切斷生物膜形成的首要條件，對臨床治療具有一定的意義。

本研究對萬古霉素及去甲萬古霉素的使用也進行了回顧性分析評價，這一部分將在另一篇文獻進行論述。

綜上所述，在本研究中，可以得出以下結論：①MRSA在兒童病房的流行應該進行監測并評估；ICU病區呼吸機引起的相關感染仍是一大難題。②本醫療機構內MRSA（2018—2019年）流行菌株以t437-SCCmecI型為主要流行克隆株；提示醫療機構內部感染控制仍需提高警惕并加強監控。③MRSA攜帶黏附毒素率高，容易形成生物被膜，可以采取手段進行評估預測，針對性的新藥研發可以此為靶點進行開發研究。

參 考 文 獻

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基金項目：陜西省社會發展基金資助項目（No. 2018SF-146）

作者簡介：張麗心，女，生于1974年，博士，副主任藥師，研究方向為抗感染治療，E-mail： zlx_good@163.com