石斑魚神經壞死病毒研究進展

陳俊羽，張婧

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006）

石斑魚（Epinephelusspp）是鮨科石斑魚屬魚類的總稱，已經報道的有400 余種，其中我國沿海地區有記錄的45 種，主要有斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、赤點石斑魚（Epinephelus akaara）、棕點石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）和鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）等[1]。石斑魚常棲息于熱帶、亞熱帶暖水水域的礁石附近，最適生存水溫為22～28 ℃，在鹽度＞10%的海域均可生存。石斑魚為肉食性魚類，捕食對象包括甲殼類和各種小型魚類[2]。

神經壞死病毒為野田村病毒科的單鏈RNA 病毒，首次報道于日本長崎水產養殖研究所繁殖的鸚嘴魚（Amphilophus）和澳大利亞北昆士蘭州某孵化場養殖的澳洲肺魚（Neoceratodus forsteri）中[3]。神經壞死病毒可通過垂直或水平傳播方式侵染個體，引起魚類患病毒性神經壞死病，處理不當會導致魚類大批死亡。神經壞死病毒對漁業和水產養殖業的發展具有嚴重的危害[4]。在石斑魚養殖中，神經壞死性病可感染石斑魚腦部和眼部組織，嚴重時會導致個體死亡。在石斑魚的生長周期中，稚魚時期及成熟度相對較高的幼魚期易感染，且死亡率達到60%～100%[5]。

石斑魚神經壞死病的致病機理、檢測方法以及防治措施一直是研究人員關注的重點和難點。現簡述石斑魚神經壞死病毒的研究進展。

1 神經壞死病毒的分類

目前神經壞死病毒主要有2 種分類方式：基因型和血清型。1997 年，Nishizawa 等[6]通過分子系統發育，分析25 種神經壞死病毒RNA2 序列第604～1 030 位堿基的差異，把神經壞死病毒分為4個基因亞型，即紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）神經壞死病毒（TPNNV）、擬鲹（Pseudocaranx）神經壞死病毒（SJNNV）、條斑星鰈（Verasper moseri）神經壞死病毒（BFNNV）和赤點石斑魚型神經壞死病毒（RGNNV）。隨著生物技術的發展，2010 年，Johansen 等[7]通過序列比對，發現了第5 種神經壞死病毒的基因型：大菱鲆（Scophthalmus maximus）型神經壞死病毒。這一研究，進一步完善了神經壞死病毒的基因型分類依據。

2003 年，Morit 等[8]根據來源于日本、印尼、泰國、希臘、美國和澳大利亞等20 種神經壞死病毒的血清，開展中和試驗，將神經壞死病毒分為3 種血清型：A、B 和C，見表1。擬鲹神經壞死病毒屬于血清型A 類，宿主為黃帶擬鲹（Pseudocaranxdentex）；紅鰭東方鲀神經壞死病毒屬于血清型B 類，赤點石斑魚神經壞死病毒與條斑星鰈神經壞死病毒同屬于血清C 類。赤點石斑魚神經壞死病毒的宿主多為溫水魚類，條斑星鰈神經壞死病毒的宿主多為冷水魚類，雖然屬于不同的基因型分類，但是由于其衣殼蛋白序列的相似性較高，導致這2 種病毒之間存在共同的表位，即相同的血清類型。

表1 魚類神經壞死病毒的基因型與血清型[3]

2 神經壞死病毒的結構

神經壞死病毒粒子呈20 面體對稱結構，無囊膜包裹，直徑約25～30 nm。180 個衣殼蛋白，以三聚體形式構成高度對稱的中空結構，其中P 結構域由8 個反向平行的β 折疊和1 個α 螺旋折疊，形成獨立的表面突起，在病毒的黏附入侵過程中發揮著重要作用。排列整齊的N 臂主要存在于20 面體內表面的二重界面處，通過N 端在三重軸處形成β 環。S結構域和P 結構域通過連接區域連接，二者在空間上并不直接接觸。60 個P 結構域三聚體在三重軸上相互連接形成表面突起[9]。

3 侵染石斑魚引發的免疫反應機制

研究表明，宿主細胞表面受體在病毒入侵過程中發揮重要作用，可以是病毒進入細胞的通道，也可以引發細胞自噬，誘導細胞凋亡[10]。Zhang等[11]研究發現，赤點石斑魚神經壞死病毒表面的衣殼蛋白，與受體海鱸（Perca fluviatilis）熱休克蛋白90ab1 結合后，抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路，引發細胞自噬過程。這一結果，初步揭示了神經壞死病毒在侵染初期的細胞應答機制。巨噬細胞是硬骨魚類先天免疫系統的關鍵組成部分。活化的巨噬細胞分泌免疫因子指導炎癥的消退，對于魚體的健康至關重要[12]。小膠質細胞被認為是中樞神經系統中的免疫效應因子，在點帶石斑魚（Epinephelus coioides）中樞神經系統損傷的治療中發揮重要作用。研究發現，神經壞死病毒進入石斑魚腦組織后，小膠質細胞可以轉化為M1 型或M2 型活化巨噬細胞。M1 型活化巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子1（TNF-R1），導致腫瘤壞死因子α（TNFα）表達水平升高，抗炎細胞因子IL-10 降低，引發神經系統損傷。與之相對，M2 型巨噬細胞分泌抗炎細胞因子IL-10 和腫瘤壞死因子2（TNF-R2）能夠減輕腦部挫傷，促進神經元恢復，可降低病毒對腦和神經組織的傷害[13-14]。

4 感染模型的建立

在細胞生物學層面，1991 年，Frerichs 等[15]以條紋月鱧（Channomuraena vittata）細胞為基礎，成功建立神經壞死病毒感染模型，標志著細胞生物學檢測方法的正式建立。目前已經建立的神經壞死病毒敏感細胞系，包括褐點石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）鰭條組織、心臟組織以及鰾部細胞系[16]、青石斑魚及斜帶石斑魚腦組織細胞系[17]、云紋石斑魚（Epinephelus moara）吻部、心臟、腦部、腎臟、脾臟以及性腺組織細胞系等[18]。研究人員以上述細胞系為基礎，將神經壞死病毒大量增殖形成空斑等拉網病變后，進行分離純化，獲得具有一定感染能力的活病毒，從而達到檢測的目的。

5 檢測方法

目前常用的神經壞死病毒檢測方法有分子生物學檢測法、電化學檢測法以及免疫學方法。在分子生物學層面，熒光定量PCR 技術、環介導等溫擴增技術和交叉引物等溫擴增技術等，都是常用的神經壞死病毒檢測方法。其中，熒光定量PCR 技術較為常見。測試發現，該方法在檢測點帶石斑魚神經壞死病毒感染時，靈敏度較高，但耗時較長[19]。Zhao 等[20]在聚合酶鏈式反應體系中加入SYTO-9 熒光染料后，實時檢測擴增曲線，將所需的檢測時間縮短至40 min，滿足了疾病檢測快速準確的診斷要求。目前，納米銀溶膠探針檢測方法和切向流試紙條法的電化學檢測法引起了研究人員關注，有望成為新興的神經壞死病毒快速檢測方法[21]。

免疫學相關技術為較早應用于神經壞死病毒檢測的方法之一。目前，利用免疫學相關技術，應用于水生動物神經壞死病毒檢測方法，主要有酶聯反應吸附試驗和熒光抗體法等。1992 年，Arimoto 等[22]發現，使用酶聯免疫吸附技術，在黃帶擬鲹的魚卵、幼魚和稚魚中均檢測到神經壞死病毒，但是該方法靈敏度不高且需要的魚組織量相對較大。2018 年，韓國學者Gye 等[23]改進了免疫學檢測技術，提高了檢測特異性，降低了硬骨魚抗原-抗體非特異性結合反應引起的背景光密度偏高問題。

6 預防措施

目前石斑魚神經壞死病的預防措施，主要有轉基因飼料預防和接種疫苗預防2 種方式。Lin 等[24]將赤點石斑魚神經壞死病毒外殼蛋白基因重組至鹵蟲細胞中，飼喂石斑魚幼魚。結果顯示，被神經壞死病毒侵染后的幼魚存活率提高了30%，由此證明口服轉基因飼料，可以使石斑魚幼魚獲得一定的免疫效果。萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）具有生長周期快、性狀穩定、遺傳背景清晰等特點，郭德權[25]將病毒性神經壞死病毒外殼蛋白基因整合入萊茵衣藻基因組中，利用該轉基因混合飼料投喂珍珠龍膽石斑魚后，進行攻毒試驗，采用熒光定量PCR技術，發現神經壞死病毒外殼蛋白mRNA 含量減少60%；病理切片發現，腦組織細胞空泡化數量減少，試驗組的平均存活率比對照組高33%。上述研究結果表明，轉基因混合飼料對預防石斑魚病毒性神經壞死病有一定作用。

在石斑魚病毒性神經壞死病的防治中，以接種疫苗預防為主。目前，針對神經壞死病毒開發的疫苗包括福爾馬林滅活病毒疫苗、重組外套蛋白亞基疫苗、病毒顆粒疫苗以及RNA 疫苗等[26]。神經壞死病毒主要作用于石斑魚幼魚階段，該階段魚體的免疫系統未充分發育，疫苗的保護效果十分有限[27]。現多采取親本魚注射疫苗的方法，切斷病毒的垂直傳播途徑，使子代獲得先天性病毒免疫能力[28-29]。Gye 等[30]使用不同效價的疫苗注射七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）試驗發現，神經壞死病毒滅活疫苗的有效性與誘導免疫細胞產生中和抗體的滴度有關，滴度越高疫苗的保護能力越強。石斑魚養殖水域的溫度也對神經壞死病疫苗的免疫效果有一定影響。研究發現，已接種疫苗的七帶石斑魚在不同水溫下，腦部組織中神經壞死病毒的濃度不同，水溫為14.3～24.8 ℃，神經壞死病毒疫苗的免疫效果較好[31-32]?，F今，尋找神經壞死病毒入侵魚體后細胞作用的靶點和高效激活免疫通路的相關細胞因子，是疫苗研究的主要方向[33]。

7 治療方法

注射神經壞死病毒特異性抗體是目前廣泛采用的治療手段。Yamashita 等[33]對七帶石斑魚腹腔內注射福爾馬林滅活的赤點石斑魚神經壞死病毒后，其死亡率明顯下降。朱松[34]選取金剛烷胺作為抗神經壞死病毒藥物，利用納米靶向給藥系統，延長藥物作用時間的同時提高了準確率。但長期使用抗病毒藥物會增加病毒的耐藥性，且金剛烷胺在魚體的殘留，危害人類健康，因此該治療方法仍存在一定的爭議[35]。

利用碳酸鹽緩沖液進行輔助治療，是防治神經壞死病毒感染的新思路。研究表明，于石斑魚腹腔內注射pH 值為9.6 的碳酸鹽緩沖溶液，可有效清除神經壞死病毒抗原，降低病毒的感染性[36]。2021 年，Gye 等[37]發現，2.0 mol/L 的尿素也可降低神經壞死病毒的抗原性，與對照組相比，試驗組病毒的抗原性下降75%～84%。Xiao 等[38]從健康的鞍帶石斑魚中分離出干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、副伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）和路德維希大腸桿菌（Enterobacter ludwigii），并將上述復合益生菌喂食患病的石斑魚，發現食用益生菌混合飼料的病魚，眼部和腦組織中神經壞死病毒RNA 的表達量顯著下降。這一結果為石斑魚病毒性神經壞死病的治療提供了新思路。

8 結語

目前，神經壞死病毒侵染石斑魚的致病機制仍未完全闡明，感染后的治療手段也尚未成熟。在防治方法方面，接種疫苗等其他預先建立免疫屏障的防治措施比感染后再治療的效果更好。與此同時，碳酸鹽緩沖液療法及復合益生菌療法為治療手段提供了新思路，在一定程度上解決了抗生素耐藥性及水產養殖中抗生素的殘留問題，值得推廣。