全雄黃顙魚(yú)紅頭病病原菌的分離鑒定

馬士杰，郭錦志，魏嬌，付立霞

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）在分類(lèi)上隸屬鲇形目、鲿科、黃顙魚(yú)屬，又名昂刺魚(yú)、黃辣丁、黃姑魚(yú)，生存水溫為0～38 ℃，最適宜的生長(zhǎng)水溫為22～28 ℃，多棲息于緩流多水草的湖周淺水區(qū)和入湖河流處，營(yíng)底棲生活，尤其喜歡生活在靜水或緩流的淺灘處以及腐殖質(zhì)多和游泥多的地方。雜食性，自然條件下以動(dòng)物性飼料為主，魚(yú)苗階段以浮游動(dòng)物為食，成魚(yú)則以昆蟲(chóng)及其幼蟲(chóng)、小魚(yú)蝦、螺蚌等為食，也吞食植物碎屑。分布于老撾、越南、中國(guó)、朝鮮、俄羅斯西伯利亞?wèn)|南部，在中國(guó)分布于珠江、閩江、湘江、長(zhǎng)江、黃河、海河、松花江及黑龍江等水系。其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是我國(guó)常見(jiàn)的一種淡水名優(yōu)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1]。普通黃顙魚(yú)產(chǎn)量低，個(gè)頭小，品質(zhì)參差不齊，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，且鲿科魚(yú)類(lèi)雄性要比雌性魚(yú)生長(zhǎng)速度快很多，倘若增加雄魚(yú)的占比，則可以大大增加養(yǎng)殖效益，于是一種通過(guò)性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育的方法產(chǎn)出的全雄黃顙魚(yú)問(wèn)世了[2]。研究表明，這種全雄黃顙魚(yú)無(wú)論是養(yǎng)殖產(chǎn)量、出塘規(guī)格還是養(yǎng)殖效益、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，均遠(yuǎn)高于普通的黃顙魚(yú)[3]。

在黃顙魚(yú)的養(yǎng)殖過(guò)程中，常出現(xiàn)一種季節(jié)性的流行性細(xì)菌疾病。病魚(yú)腹部膨大，魚(yú)體各部位有不同程度的充血，頭頂部位出現(xiàn)紅點(diǎn)狀潰爛，嚴(yán)重時(shí)頭頂部開(kāi)裂并有出血帶，呈現(xiàn)典型的“紅頭”癥狀，常被稱(chēng)為“紅頭病”。該病高發(fā)于春季和秋季，主要危害黃顙魚(yú)種或成魚(yú)。紅頭病蔓延速度快，致死率高，防治困難，常給殖戶(hù)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不同養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚(yú)發(fā)病的致病菌有所不同，分別為遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）、愛(ài)德華菌（Edwardsiella ictaluri）或同屬的愛(ài)德華菌亞種[4-5]。現(xiàn)以患紅頭病的全雄黃顙魚(yú)為研究對(duì)象，從其病灶處分離純化得到病原菌，通過(guò)形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA 等方面鑒定，以及藥敏和斑馬魚(yú)人工感染試驗(yàn)，分析其藥敏特性及致病性，以期為全雄黃顙魚(yú)“紅頭病”的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品、菌種來(lái)源

全雄黃顙魚(yú)購(gòu)自高郵董氏特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，體長(zhǎng)為（14±1）cm，體質(zhì)量為（54±5）g；斑馬魚(yú)購(gòu)自廣東省惠州市惠城區(qū)球記養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為（3.5±0.5）cm，體質(zhì)量為（0.6±0.1）g。從患病全雄黃顙魚(yú)病灶處分離純化得到受德華菌株YCH；殺魚(yú)愛(ài)德華菌SHK 和SHL、遲緩愛(ài)德華菌ET-1 和ET-13 來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器

LB 肉湯（LB）、腦心浸出液肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、SS 瓊脂（SS）由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；革蘭染色液、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及藥敏紙片由杭州濱和微生物試劑有限公司提供；基因組提取試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit、膠回收試劑盒TIANgel Mini Purification Kit 由天根生化科技（北京）有限公司提供；Premix Taq（plus dye）、DNA A-Tailing Kit、pMD 19-T Vector Cloning Kit、Prime STAR HS (Premix)、DL 2000 DNA Marker 和DL 5000 DNA Marker 由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司提供；所有引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；麻醉劑MS-222由美國(guó)默克公司提供。主要儀器設(shè)備有無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、PCR 儀伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

表1 引物及其序列①

1.3 菌種的分離及純化

從實(shí)驗(yàn)室選取病癥較為典型的瀕死黃顙魚(yú)，用75%乙醇對(duì)其體表消毒，無(wú)菌剖檢。用接種環(huán)取其頭部潰爛處及肝臟、腎臟組織，于BHI 平板上劃線(xiàn)，放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。選取平板上大小、形狀、色澤一致的優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落，接種到5 mL的BHI 液體培養(yǎng)基中，放入28 ℃搖床于170 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)活化。次日待試管內(nèi)液體培養(yǎng)基渾濁，用接種環(huán)蘸取適量菌液，再次于BHI 平板上劃線(xiàn)，選取大小、形狀、色澤一致的優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線(xiàn)培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)。取部分菌液裝入離心管，于8 000 r/min 離心15 min，加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、吹打，使菌液與PBS 充分接觸，將清洗后的菌液以1∶1 的比例與30%的BHI 甘油混合，充分渦旋封口，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 YCH 菌體特征及生理生化

1.5 16S rRNA 序列分析

采用TIANGEN 小提基因組試劑盒，提取YCH的基因組，提取步驟參照說(shuō)明書(shū)。將提取好的基因組作為模板，利用引物27 F/1492 R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL，Premix Taq 酶25 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸5 min；于4 ℃保存。

待PCR 反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，再于紫外燈分析儀下對(duì)凝膠進(jìn)行切膠回收所需目的片段，連接pMD19-T Vector 載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序得到的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，篩選相關(guān)性最高的細(xì)菌序列，通過(guò)MEGA11 中的Align組件進(jìn)行序列排列后，采用鄰接法（Neighbor-Join Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)自舉法（Bootstrap）進(jìn)行可信度檢驗(yàn)，自舉時(shí)重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法，對(duì)分離的優(yōu)勢(shì)菌株YCH 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并參照說(shuō)明書(shū)對(duì)數(shù)據(jù)分析。在超凈工作臺(tái)，將優(yōu)勢(shì)菌株YCH 接種至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后，用無(wú)菌PBS洗滌并稀釋調(diào)整至5×107～5×108CFU/mL；取100 μL菌懸液，用滅菌的涂布棒均勻地將菌液涂布于BHI平板上，用滅菌的鑷子將藥敏紙片貼附于培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)量藥敏紙片的抑菌圈直徑（mm）。根據(jù)杭州濱和微生物試劑有限公司提供的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判定。

1.7 人工感染試驗(yàn)

攻毒菌株YCH 接種于BHI 液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后（OD600約為0.6），離心收集菌體，用pH 值為7.2～7.4 PBS 洗滌3 次，10 倍梯度稀釋成5 種不同濃度（2.3×109，2.3×108，2.3×107，2.3×106和2.3×105CFU/mL）菌懸液備用，同時(shí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以獲得更為精確的菌液濃度。

試驗(yàn)共設(shè)置6 組，分別為1 個(gè)空白對(duì)照組和5 個(gè)試驗(yàn)組，將健康的斑馬魚(yú)暫養(yǎng)7 d 后，每組20 尾，于規(guī)格相同的水族箱中。試驗(yàn)組分別注射上述5 種不同濃度的菌株YCH，對(duì)照組則注射無(wú)菌PBS。注射前，用質(zhì)量濃度50 mg/L 的MS-222 麻醉劑將待注射魚(yú)麻醉，防止注射時(shí)魚(yú)體掙扎，導(dǎo)致機(jī)械損傷。攻毒方式為腹腔注射，注射劑量為20 μL。試驗(yàn)期間，對(duì)人工感染后的斑馬魚(yú)正常喂食，對(duì)養(yǎng)殖水體連續(xù)充氣、換水，連續(xù)觀察7 d，記錄每日發(fā)病和死亡數(shù)量，并對(duì)感染發(fā)病斑馬魚(yú)再次進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定（新分離出的菌株命名為YCH-2），最后根據(jù)Reed-Muench 公式[10]計(jì)算菌株YCH 對(duì)斑馬魚(yú)的半數(shù)致死量（LD50）。

1.8 特異性引物檢測(cè)

使用特異性引物ESC-F、ESC-R，對(duì)YCH、YCH-2及愛(ài)德華其他菌屬進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定[8]。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，78 ℃延伸5 min，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸5 min；于4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

從患病黃顙魚(yú)體內(nèi)分離獲得1 株優(yōu)勢(shì)菌株，在BHI 培養(yǎng)基平板劃線(xiàn)涂板于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后可見(jiàn)生長(zhǎng)緩慢的菌落，48 h 后可見(jiàn)菌落逐漸明顯，呈圓形、透明或半透明，邊緣整齊，灰白色或者無(wú)色的細(xì)小微凸起菌落，見(jiàn)圖1（a）；經(jīng)革蘭染色、1 000 倍油鏡觀察顯示，分離菌株YCH 為革蘭陰性菌，呈紅色短桿狀，見(jiàn)圖1（b）。

圖1 菌株YCH 的形態(tài)特征

2.2 16S rRNA 基因序列

以YCH 菌株基因組作為模板，經(jīng)擴(kuò)增得到的16S rRNA 片段大小約為1 466 bp（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示，YCH 菌株16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與Gen Bank 中愛(ài)德華菌的相似度高達(dá)99%，YCH 菌株16S rRNA 基因序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，菌株YCH與愛(ài)德華菌為一支（圖3）。

圖2 16S rRNA 基因的PCR 產(chǎn)物

2.3 生理生化鑒定

通過(guò)系列微量生化反應(yīng)管，對(duì)分離菌株YCH進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株YCH 與賴(lài)氨酸、葡萄糖、麥芽糖等試劑反應(yīng)呈陽(yáng)性，與精氨酸、枸櫞酸鹽、甘露醇、水楊素、硫化氫、七葉靈等試劑反應(yīng)呈陰性（表2），與參照菌株愛(ài)德華菌JXHS 數(shù)據(jù)一致，與遲緩愛(ài)德華菌ATCC15947 的數(shù)據(jù)較為相似；菌株YCH 和參照菌株JXHS 的硫化氫為陰性，而遲緩愛(ài)德華菌ATCC15947 的硫化氫為陽(yáng)性。

表2 菌株YCH 的生理生化特性①

2.4 藥敏

菌株YCH 對(duì)35 種藥物的敏感性見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，菌株YCH 對(duì)紅霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氨曲南、頭孢西丁、氧氟沙星和妥布霉素等8種藥物耐藥，對(duì)青霉素、克林霉素及卡那霉素中度敏感，而對(duì)其他24 種測(cè)試藥物，包括苯唑西林、大觀霉素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、左氟沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、鏈霉素、呋喃妥因和頭孢唑啉、頭孢呋辛等則均為敏感。

表3 菌株YCH 對(duì)35 種藥物的敏感性①

續(xù)表

2.5 人工感染后癥狀

人工感染健康的斑馬魚(yú)后，高濃度組注射1 d后就開(kāi)始出現(xiàn)死亡，對(duì)照組未見(jiàn)異常。2～4 d 為各組發(fā)病死亡高峰期，被感染的斑馬魚(yú)出現(xiàn)與自然發(fā)病黃顙魚(yú)相似的癥狀，魚(yú)腹部鼓起并伴有腹水、體表充血、皮膚潰爛、眼球外突，雖未見(jiàn)頭部裂開(kāi)，但頭部出現(xiàn)明顯的腫脹突起（圖4）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組斑馬魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)死亡，試驗(yàn)組中菌株濃度為2.3×109和2.3×108CFU/mL 組死亡率最高，均為100%；其次是2.3×107CFU/mL 組，死亡率為68.4%；2.3×106和2.3×105CFU/mL 組死亡率較低，分別為7.4%和0。根據(jù)Reed-Muench 方法計(jì)算，菌株YCH 對(duì)斑馬魚(yú)的LD50為2.3×105CFU。從死亡病魚(yú)體內(nèi)能再次分離到細(xì)菌，且形態(tài)特征及理化特性等方面均與所述菌株YCH 完全一致。分離菌株YCH 對(duì)斑馬魚(yú)的人工感染試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

圖4 健康斑馬魚(yú)和被感染后的病魚(yú)對(duì)比

表4 分離菌株YCH 對(duì)斑馬魚(yú)的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.6 特異性引物

特異性引物檢測(cè)結(jié)果顯示，從患紅頭病的全雄黃顙魚(yú)體內(nèi)分離的菌株YCH 及再次人工感染斑馬魚(yú)后分離所得菌株YCH-2，均可用ESC-F、ESC-R擴(kuò)增出129 bp 的預(yù)期目的條帶，而同組的其他菌株均未擴(kuò)增出條帶（圖5）。

圖5 種特異性引物對(duì)愛(ài)德華菌分離菌株的鑒別

3 討論

黃顙魚(yú)在規(guī)模化人工養(yǎng)殖中易感染各種疾病，導(dǎo)致頭部發(fā)紅的主要致病菌為愛(ài)德華菌。愛(ài)德華菌屬分為愛(ài)德華菌、保科愛(ài)德華菌（Edwardsiella hoshinae）和遲緩愛(ài)德華菌，其中遲緩愛(ài)德華菌的分布和宿主范圍比保科愛(ài)德華菌和愛(ài)德華菌更加廣泛[13]。愛(ài)德華菌是導(dǎo)致鲇形目魚(yú)類(lèi)發(fā)病的一種常見(jiàn)致病菌，于1979 年在美國(guó)的斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）體內(nèi)首次分離獲得[14]。流行病學(xué)與病理特征分析發(fā)現(xiàn)，愛(ài)德華菌和遲緩愛(ài)德華菌導(dǎo)致的疾病分為急性型與慢性型，其中急性型發(fā)病速度快，會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)臟功能衰退，若救治不及時(shí)，一周內(nèi)就會(huì)導(dǎo)致大量死亡；慢性型則通常呈階段性，初期發(fā)病魚(yú)表征不明顯，先出現(xiàn)體表不同程度的病變，隨之?dāng)z食量減少；隨病程發(fā)展，出現(xiàn)停食、頭頂部充血、發(fā)紅、潰爛等現(xiàn)象，并伴隨體表潰爛、泄殖孔紅腫充血，頭部由最初的潰爛直至露出頭骨及腦組織。

斑馬魚(yú)作為一種新型的脊椎模式生物，具有繁殖能力強(qiáng)、個(gè)體小、易養(yǎng)殖等諸多優(yōu)點(diǎn)[15]。在毒性試驗(yàn)中有著非常有利的生物學(xué)特性，使其成為感染研究中重要的模型生物之一。劉春等[16]以斑馬魚(yú)為試驗(yàn)動(dòng)物，研究與愛(ài)德華菌同屬的遲緩愛(ài)德華菌的致病力并得到證實(shí)。Hawke 等[17]于2011 年在美國(guó)不同州實(shí)驗(yàn)室的斑馬魚(yú)體內(nèi)，分離得到了愛(ài)德華菌。本試驗(yàn)認(rèn)為，愛(ài)德華菌感染鲇形目魚(yú)類(lèi)比較多，從斑馬魚(yú)身上分離得到愛(ài)德華菌，且癥狀與黃顙魚(yú)人工感染癥狀相似，感染的斑馬魚(yú)在1～2 周內(nèi)快速死亡。在國(guó)內(nèi)斑馬魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)中，也在病魚(yú)體內(nèi)分離到了愛(ài)德華菌，回歸感染致死率可達(dá)80%[18]。說(shuō)明斑馬魚(yú)可作為愛(ài)德華菌毒性試驗(yàn)的模式動(dòng)物，代替黃顙魚(yú)做人工感染試驗(yàn)。

本研究從患有“紅頭病”的全雄黃顙魚(yú)中，分離純化獲得優(yōu)勢(shì)菌體YCH。該菌株的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)以及16S rRNA 的基因序列分析比對(duì)結(jié)果顯示，菌體YCH 為愛(ài)德華菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，苯唑西林、大觀霉素、左氟沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、鏈霉素和頭孢呋辛等成分的藥物對(duì)該病菌的生長(zhǎng)有抑制作用，這對(duì)日后愛(ài)德華菌的防治及研究有著積極的推進(jìn)作用。

本試驗(yàn)的藥敏數(shù)據(jù)在實(shí)際生產(chǎn)中僅作參考，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，應(yīng)選擇合適的國(guó)標(biāo)魚(yú)藥，同時(shí)，需注意用藥量，避免產(chǎn)生耐藥性。由于“紅頭病”的病灶通常位于魚(yú)腦部，很多藥物無(wú)法很好地直擊病灶處，且愛(ài)德華菌在環(huán)境溫度適宜的情況下暴發(fā)迅速，養(yǎng)殖戶(hù)常常來(lái)不及反應(yīng)而造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中，要注重飼料配比，適當(dāng)添加維生素等微量元素，以增加魚(yú)體抵抗力。同時(shí)要注重養(yǎng)殖水質(zhì)，提升養(yǎng)殖水環(huán)境質(zhì)量。疾病防治原則是以預(yù)防為主，防治結(jié)合。