MutL 調控水稻黃單胞菌的致病力

米 多，陳 雨，邢 蕓，陳銀華，陶 均，李春霞

（海南大學 海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室/熱帶作物學院，?？?570228）

DNA 是大多數生物的遺傳信息載體，是保證物種延續性的基礎，微小的變化都可能對細胞產生致命的影響[1]。在生命進化的過程中，DNA 一直受到外界環境和內部因素的影響。細胞中dNTPs 和rNTPs 濃度改變、DNA 聚合酶保真性變化和外界環境改變都可能導致高突變率和非完全同源DNA 序列之間的重組能力增加，進而影響基因組的穩定性[2]。DNA 錯配修復（mismatch repair，MMR）系統可以糾正復制和重組過程中發生的DNA 堿基錯配，確保染色體復制的精確性和維持基因組的穩定性[3]。

MutL/MutS 是原核生物最重要的MMR 系統。DNA 錯 配 修 復 蛋 白 MutL 羧 基 端 含MLH1 和PMS2 二聚體結構域，其中PMS2 具有內切酶活性；MutL 氨基端具有ATP 酶和DNA 結合活性[4-6]。當MMR 復合體中的另一個關鍵蛋白MutS 識別并結合到發生堿基錯配位點時，其構象發生變化，招募MutL 形成修復復合體，對錯配序列進行修復[7-8]。

在大腸桿菌中，MutL 發揮內切酶作用，在錯配位置產生切口[9]，阻斷DNA 鏈繼續合成。MutL 的DNA 結合位點突變會使MutL 無法結合在發生錯誤的DNA 位點，MMR 系統不能發揮正常功能，活性下降，錯配序列無法修復，顯著提高細菌的突變率[10-12]。在銅綠假單胞菌中，MutL 也具有DNA 切割活性，使發生錯配的DNA 雙鏈斷裂，然后通過非同源端連接進行DNA 修復。非同源端連接將提高染色體缺失的可能性，染色體的缺失導致銅綠假單胞菌產生棕色突變體，這種顏色的突變體可以防止噬菌體捕食[13]。在人和多數模式生物中，MutL 的功能已有廣泛研究[14-16]，但其是否與病原菌的致病性相關還未見報道。

白葉枯病是影響水稻生產最嚴重的細菌性病害，由水稻黃單胞菌白葉枯致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）侵染所致[17]。Xoo致病力受很多因素調控，調控途徑也不相同，不同途徑間還有相互影響，是外界環境和內在因素共同作用的結果[18]。目前的研究表明，基礎代謝、外源信號感應與傳遞、分泌系統及其分泌蛋白是調控Xoo致病力的關鍵因素[19-20]。Xoo侵染水稻時，水稻會產生防衛反應，產生大量有毒的物質如活性氧等毒害病原菌[18]，導致其突變增加，生存受到挑戰[19]。病原菌要成功侵染必須要有高效的應對措施。DNA 損傷修復是保證病原菌應對外界環境不利影響的重要措施之一[9]。因此，MMR 應該在此過程中起到非常重要的作用，但相關研究還未見報道。本實驗研究MutL 是否參與XooDNA 錯誤修復以及是否調控病原菌的致病力，旨在為白葉枯病的防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒PXO99A菌株和pK18mobSacB質粒為筆者所在的實驗室保存，大腸桿菌菌株購自全式金生物技術有限公司。

1.2 培養基與試劑PSA 培養基：1%胰蛋白胨、1%蔗糖、0.1%谷氨酸鈉；PGA 培養基：1%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.1% 谷氨酸鈉；PSSU 培養基：1%胰蛋白胨、15%蔗糖、0.1%谷氨酸鈉；LB 培養基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl；M4M 培養基：0.048% Na2HPO4、0.03% KH2PO4、0.05%檸檬酸鈉、0.1% (NH4)2SO4、0.05%酶水解酪素、0.02% MgSO4·7H2O、0.05%葡萄糖。固體培養基另加1.5%的瓊脂。DNA 凝膠回收及質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。高保真DNA 聚合酶、限制性核酸內切酶及T4 連接酶購自NEB 公司。其他試劑購自廣州化學試劑公司。

1.3 引物設計與合成根據基因兩端序列，運用軟件Primer 5 分析、設計引物（表1），并由生工生物工程（廣州）分公司合成。

表1 本實驗引物

1.4 mutL 突變體的構建及致病力檢測PCR 擴增mutL上下游各約500 bp 序列，分別用HindIII/BamHI 和BamHI/EcoRI 酶切后一起連接到經HindIII/EcoRI 酶切的自殺性載體pK18mobSacB上，熱激法轉化大腸桿菌，獲得pK18-mutL載體，測序正確后采用同源重組、兩次交換的方法構建突變體。采取剪葉法，在TP309 水稻葉片上接種野生型菌株PXO99A和mutL突變體，14 d 后量取從剪口處到枯斑內部邊界的長度，統計病斑長度與數量。

1.5 檢測Xoo 生長速度

1.5.1生長曲線的測定PXO99A、△mutL菌株培養（PSA 培養基、28 ℃、180 r·min-1）36 h 后，按1∶100 轉接于10 mL PSA 中，用全自動微生物生長曲線分析儀每2 h 測定1 次OD600值。

1.5.2在缺陷培養基上的生長情況將PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培養36 h，M4M 培養基清洗2 遍，調至OD600=1.0，再稀釋至10-7共8 個梯度，取2 μL 菌懸液點板（PSA 和M4M 固體培養基）28 ℃倒置培養，2～3 d 拍照。

1.6 H2O2 誘導情況下Xoo突變率的測定PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培養36 h 后，1∶100轉接于500 mL PSA 中，待培養到對數生長期，ddH2O 清洗1 次，調OD600=1.0，取相同體積菌液，用終濃度40 mmol·L-1的H2O2處理菌液30 min，ddH2O 清洗過氧化氫2 遍，最后用6 mL ddH2O 重懸，取出100 μL 菌液稀釋到10-7、10-8后，稀釋液涂PSA 平板，計算菌落總數（A）；其余菌液（5.9 mL）涂布于PSA 加利福平的平板上，28 ℃ 培養3 d，統計菌落數（B）。B 與A 的比值即為突變率。

1.7 互補菌株的構建PCR 擴增全長mutL，產物回收后無縫克隆到HindIII/EcoRI 酶切的廣宿主載體pHM1 上。PCR 驗證轉化大腸桿菌獲得的單菌落，對陽性克隆進行測序分析。測序正確的質粒用電擊法轉入到ΔmutL，獲得互補菌株（C-ΔmutL）。

2 結果與分析

2.1 mutL 缺失突變導致Xoo致病力下降以PXO99A為野生型菌株，經過2 次同源重組后mutL基因被缺失突變。以mutL兩側引物進行PCR，以PXO99A和ddH2O 作對照。如圖1-A 所示，mutL突變體的擴增片段比野生型擴增片段短，約1 800 bp，正好符合mutL基因片段大?。? 878 bp），表明mutL突變體（ΔmutL）構建成功。為了進一步分析mutL的功能，構建了mutL的互補菌株C-ΔmutL。將PXO99A、mutL突變體及其互補菌株接種TP309 水稻，結果顯示mutL突變體的病斑長度比野生型及其互補菌株都短，野生型和互補菌株間沒有顯著差異（圖1-B、C）。說明mutL正調控Xoo的致病力。

圖1 mutL 突變體的構建及其致病力分析

2.2 mutL 突變并不顯著影響Xoo的生長MutL的功能是對細胞DNA 錯配進行修復，維持細胞生命活動的正常進行，其突變可能改變其生長。因此，本研究檢測了mutL突變是否影響Xoo的生長速度。結果顯示，在豐富性培養基(PSA)和營養營養缺陷型培養基（M4M）中，ΔmutL的生長速率都略低于PXO99A（圖2- A 和圖2-B），但沒有顯著差異。說明MutL 在正常情況下并不顯著影響Xoo的生長。

2.3 MutL 參與XooDNA的應急修復H2O2是常見的活性氧種類，與二價鐵離子發生Fenton反應，反應產物中的羥自由基具有極強的氧化能力，會對DNA 產生損傷。細胞MMR 系統可以修復損傷DNA，使其遺傳穩定。但突變mutL后，MMR 系統受損，細胞DNA 修復功能會減弱，可能增加細菌的突變率。突變率通常采用菌株利福平抗性獲得率來表示[19]。因此，將對數生長期的野生型PXO99A和ΔmutL菌株進行H2O2脅迫處理，然后涂布在含利福平的平板上生長。3 d 后的統計結果顯示，與PXO99A相比，△mutL的突變率顯著增加(圖2- C)，說明MutL參與Xoo的DNA 修復。

圖2 MutL 對Xoo 生長和突變修復的調控作用

3 討 論

在病原菌侵染過程中，病菌自身會改變其代謝活性、毒素合成和分泌能力等，逃避宿主攻擊[18-20]。同時宿主在對抗病原菌時也會產生多種防御機制[21]。其中快速產生活性氧（ROS）限制細菌生長繁殖是植物普遍的防御機制[21]。細菌成功侵染必須要快速適應這種高ROS 環境。一方面，病原菌在感染植物過程中會誘發ROS 清除酶表達，進而清除ROS；另一方面，細菌會修復由ROS 帶來的損傷，包括DNA 和其他大分子物質，幫助病原菌適應宿主環境并成功繁殖[21]。因此，DNA 損傷修復對病原菌成功侵染是重要的。在細菌中，MutL/MutS 系統是主要的修復系統，其突變將導致細菌自發突變率增加、抗逆性降低、環境適應能力減弱[3]。對病原菌而言，MutL/MutS 可能對病原菌適應宿主體內環境起到重要的作用。

本研究結果表明，mutL突變導致Xoo在水稻TP309 上的致病力降低（圖1)，說明MutL 調控Xoo的侵染過程，是Xoo致病性相關的調節因子。同時，在正常條件下（無論是在豐富型還是營養缺陷型培養基中），mutL突變都未顯著改變Xoo的生長狀況（圖2），說明MutL 可能不是直接調控細菌生長來影響其致病力的。如前所述，在侵染過程中植物會釋放大量ROS 對細菌生長和DNA 造成損傷[21]。本研究結果也顯示，ROS 增多導致mutL突變體的突變率急劇增加（圖2）。這暗示MutL 調控Xoo致病力可能是由于其修復DNA 能力降低導致的，但具體機制還需進一步研究。

在大腸桿菌中，mutL突變后自發突變率比野生型高300 倍[22]。分支桿菌mutL突變也導致自發突變率增加4 倍[23]。同樣，缺失mutL的耐輻射奇球菌的自發突變率也增加了16 倍[24]。然而，本研究在Xoo中并未檢測到野生型和mutL突變體自發突變率的差異，暗示Xoo中可能存在其他主要的DNA 修復系統，而MutL 是否只有在逆境環境中才發揮功能，需進一步研究證實。