腎茶葉枯病病原的分離與鑒定

商 瑞，毛 佳，王延謙，白亭亭，楊春勇，王紅衛(wèi)，王艷芳，郭 睿，李 戈

（1.云南醫(yī)藥健康職業(yè)學(xué)院，昆明 650033; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205;3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所云南分所，景洪 666100）

腎茶[Clerodendranthus spicatus(Thunb.) C.Y.Wu]，又名貓須草，為唇形科(Lamiaceae)腎茶屬(Clerodendranthus)多年生草本植物，喜高溫多濕環(huán)境，怕寒，怕旱，忌積水，耐肥。該屬植物全世界有5 種, 主要分布于福建、臺(tái)灣、海南、廣西、廣東和云南等省[1]。腎茶全草均可入藥，性涼，味淡、微苦，具有清熱祛濕、排石利尿的療效[2]。對(duì)腎結(jié)石、膽結(jié)石、膽囊炎、尿路結(jié)石具有神奇療效，被譽(yù)為“國際利尿化石藥”[3]。腎茶除應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)外，還具有抗炎、抗腫瘤、降血糖血脂、保肝、提高機(jī)體免疫力及治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等藥理活性[4-6]。目前，由于腎茶的藥用價(jià)值較高，市場需求量越來越大，并且隨著環(huán)境氣候的變化及野生腎茶資源的破壞，野生腎茶已處于瀕危狀態(tài)，無法滿足市場需求[7]。據(jù)報(bào)道，腎茶在我國廣東、廣西、海南、云南、福建等地已有引種栽培[8]，在云南，以思茅和西雙版納地區(qū)種植最多。隨著腎茶種植面積不斷擴(kuò)大，規(guī)模化種植后發(fā)現(xiàn)其病害也隨之發(fā)生，其中腎茶葉枯病發(fā)生最嚴(yán)重，導(dǎo)致腎茶嚴(yán)重減產(chǎn)，成為阻礙腎茶規(guī)模化生產(chǎn)的重要病害。而國內(nèi)外對(duì)于腎茶的研究多集中在種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究、生藥學(xué)鑒別研究、傳統(tǒng)應(yīng)用調(diào)查研究、化學(xué)成分及其生物活性研究和部分高產(chǎn)栽培技術(shù)研究[7，9-11]。對(duì)于腎茶栽培過程中出現(xiàn)的病蟲害少見報(bào)道[12]。于旭東等[13]報(bào)道了腎茶根結(jié)線蟲的危害，嚴(yán)珍等[14]報(bào)道了腎茶新害蟲泡殼背網(wǎng)蝽的危害，關(guān)于腎茶葉枯病的研究至今未見報(bào)道。筆者針對(duì)腎茶葉枯病，進(jìn)行了病害癥狀觀察，病原菌分離、鑒定和病原菌生物學(xué)特性研究，旨在為有效防治腎茶葉枯病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所腎茶種植地里采取腎茶發(fā)病葉片。放入無菌采集袋中并編號(hào)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離純化。

1.2 腎茶病害調(diào)查對(duì)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所腎茶地的腎茶進(jìn)行病害調(diào)查。采集感染葉枯病害腎茶葉片進(jìn)行癥狀描述、拍照、鏡檢。

1.3 病原菌的分離純化采用組織分離法[15]從采回的腎茶樣本上分離病原菌，將葉片的病健交界處病組織，切成5 mm×5 mm 小塊，用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水漂洗3 次，用無菌濾紙置于PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)[16]，待菌落長出后，挑取菌落組織制片鏡檢，并進(jìn)行分離純化，觀察記錄菌落顏色和形態(tài)等培養(yǎng)特征。

1.4 病原菌的致病性測定用針刺法將分離純化培養(yǎng)7 d 的病原菌餅（直徑8 mm）接種于無病健康且長勢相近的腎茶葉片上[15]，以接種無菌PDA 培養(yǎng)基餅(直徑8 mm)作為對(duì)照，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，連續(xù)觀察7 d 記錄其病害發(fā)生情況。依據(jù)Koch's 法則，再次對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離和純化，并與原接種的分離菌株進(jìn)行比較。空白對(duì)照。用凝膠電泳法檢測PCR 反應(yīng)結(jié)果，吸取4 μL PCR 產(chǎn)物加入1% 瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE 緩 沖 液 ( 0.9 mol·L-1Tris-Borate，0.01 mol·L-1EDTA，pH8.3 ) 中，在110 V 下電泳40 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序委托北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司完成，將測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank 進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，檢索出相似性較高的ITS 序列，以確定分離菌株的分類地位；再利 用MEGA 5.1 中 的 鄰 接 法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹并分析其親緣關(guān)系[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腎茶葉枯病癥狀的觀察腎茶葉枯病是腎茶種植過程中一種常見的葉片病害，該病一般發(fā)生于腎茶葉片的葉緣、葉尖，開始為淡褐色小點(diǎn)，后漸擴(kuò)大為不規(guī)則的大型斑塊，若幾個(gè)病斑連接，1/3～1/2 葉片將變干枯，最后使整個(gè)葉片壞死脫落。除了為害葉片外，腎茶葉枯病還發(fā)生在腎茶嫩梢，嫩梢發(fā)病時(shí)變黑，枯死（圖1）。

圖1 腎茶葉枯病田間危害癥狀

1.5病原菌的鑒定

1.5.1病原菌的形態(tài)觀察將分離純化得到的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。觀察菌落的形態(tài)和顏色，并挑取菌絲置于顯微鏡下觀察記錄分生孢子的形態(tài)、大小及有無隔膜等，進(jìn)行分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定[17-18]。

1.5.2病原菌的分子鑒定將分離純化得到的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用SDS裂解法用DNA 提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取基因組DNA。選用真菌ITS 序列的通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在15 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行，Template 為1 μL，Primers(5 mmol·L-1)2 μL，10×PCR Buffer 為2 μL，dNTP 為1.6 μL，Taq酶0.1 μL，加雙蒸水至15 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序設(shè)置: 94 ℃初始變性2 min，接下來為94 ℃變性30 s，55 ℃引物退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃修復(fù)延伸10 min。擴(kuò)增中利用水代替DNA 模板為

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)及其致病性的測定對(duì)腎茶葉枯病病斑進(jìn)行病原菌分離純化得到7 個(gè)菌株，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ冕槾谭▽⒕杲臃N在離體健康的腎茶葉片上，用脫脂棉保濕，持續(xù)觀察葉片發(fā)病情況，其中6 個(gè)菌株不發(fā)病，1 號(hào)菌株接種的葉片在接種4 d 后出現(xiàn)褐色小點(diǎn)，在接種7 d 后褐色小點(diǎn)擴(kuò)大連成片，形成黑褐色病斑，發(fā)病癥狀與田間發(fā)病一致（圖2）。將菌株接種到刺傷和未刺傷的腎茶葉片上，結(jié)果刺傷的葉片會(huì)發(fā)病，未刺傷的不發(fā)病，證明腎茶葉枯病病原菌主要通過傷口侵入。將1 號(hào)菌株接種，取病健交界處組織進(jìn)行再分離，重新分離出相同的菌株。

圖2 分離菌株的致病性測定

2.3病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 在PDA 培養(yǎng)基上生長迅速，菌落呈圓形，菌絲初為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落初期下部淡粉色，后期為深黃棕色。分生孢子頂胞鉤狀，成熟的大型分生孢子有3～5 個(gè)隔膜，多為5 個(gè)，頂生或頂側(cè)生，分生孢子大小為(16.5～45) μm×(1.6～5.5 )μm（圖3），根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定腎茶葉枯病為鐮刀菌（Fusarium）。

圖3 腎茶葉枯病病原菌的形態(tài)特征

2.3.2 病 原 菌 分 子 鑒 定 以 病 原 菌 基 因 組DNA 為模板，用ITS1/ITS4 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的片段，得到1 條500 bp 條帶，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、克隆測序及BLAST 比對(duì)，該擴(kuò)增片段與Fusarium nematophilum(MT447543)，F(xiàn)usarium equiseti(MT937067)，F(xiàn)usarium chlamydosporum(MT182952)，F(xiàn)usarium longipes(MN498044)核酸序列同源性為99.40%～99.60%，結(jié)合同源菌株rDNA-ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），病原菌與Fusarium nematophilum，F(xiàn)usarium equiseti，F(xiàn)usarium chlamydosporum，F(xiàn)usarium longipes聚為一支。

圖4 分離菌株及其同源性菌株基于rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

3 討 論

腎茶多生長于高溫濕熱地區(qū)，同時(shí)也適合病原菌生長繁殖，通過對(duì)腎茶在栽培過程中的病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)葉枯病最嚴(yán)重，造成腎茶大面積減產(chǎn)，是制約腎茶規(guī)模化發(fā)展的重要瓶頸。本研究對(duì)西雙版納腎茶葉枯病病害的癥狀進(jìn)行了描述，并分離出病原菌1 株，通過致病性測定、形態(tài)特征觀察及rDNA-ITS 序列分析結(jié)果，鑒定為鐮刀菌。鐮刀菌是一種廣譜性致病菌，寄主植物種類繁多，已報(bào)道鐵皮石斛根腐病病原菌（Fusarium chlamydosporum）[20]、北蒼術(shù)枝枯病致病菌(Fusarium equiseti)[21]、辣木枝枯病病原菌(Fusarium equiseti)[22]、杭白菊葉枯病（Fusarium oxysporum）[23]、黃連根腐病（Fusarium oxysporum）[24]、藍(lán)莓鐮孢菌葉枯病（Fusarium asiaticum）[25]、地黃葉枯病（F.acuminatum）[26]等均為鐮刀菌引起，但鐮刀菌引起腎茶葉枯病尚屬首次報(bào)道。目前國內(nèi)外對(duì)腎茶葉枯病病害的研究較少，本研究后續(xù)將對(duì)腎茶葉枯病病原菌的生物學(xué)特性、病害循環(huán)、發(fā)生規(guī)律以及綜合防治等進(jìn)行深入研究，為生產(chǎn)上能更好地防控該病害提供理論依據(jù)。此外，腎茶葉枯病可參考由鐮刀菌引起的其他作物葉枯病的防治技術(shù)進(jìn)行控制，經(jīng)研究因該病為傷口侵入，在田間管理時(shí)要減少機(jī)械損傷，加強(qiáng)蟲害防治、合理密植、通風(fēng)透光、合理施肥澆水等，或在發(fā)病初期使用25%嘧菌酯和25%蚍唑醚菌酯進(jìn)行防治[27]。具體藥劑種類及綜合防治技術(shù)尚待室內(nèi)篩選試驗(yàn)和田間實(shí)踐驗(yàn)證。