紅曲霉固態發酵青稞酒工藝優化研究

何冰桃，黨 斌，2，鄭萬財，2，張文剛，2，張 杰，2，楊希娟，2

（1. 青海大學農林科學院，青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海西寧 810016；2. 青藏高原種質資源研究與利用實驗室，青海 西寧 810016）

青稞，又稱裸大麥，是青藏高原地區主要糧食作物，具有“三高兩低”的營養特點[1]。青稞還含有β - 葡聚糖、γ - 氨基丁酸、多酚等多種具有獨特生理功效的成分，可有效預防糖尿病、高血壓等多種疾病[2-3]。青稞不僅是制曲、釀造啤酒、糧食加工制品的主要原料，其還可制造藥品、糖化劑、飴糖等，對牲畜也是很好的精飼料。青稞的營養健康作用已被證實，青稞產業快速發展，產品類型越來越豐富，備受消費者青睞，青稞正在由一個區域性口糧作物轉向健康食源作物發展[4-5]。

青稞釀酒的歷史悠久，青稞除了可釀制蒸餾白酒，還可制作青稞發酵酒。目前，市面上青稞酒主要分為非蒸餾型的青稞咂酒，蒸餾型的青稞烤酒和青稞白酒，以青稞、大麥為原料的青稞啤酒、青稞清酒及調配青稞酒等[6]。相較于高濃度的青稞白酒，青稞黃酒的酒精度偏低，一般為8～15%Vol，香醇而不烈，老少皆宜，且保留了青稞豐富的營養成分，具有更加廣闊的市場，但是市面上的青稞黃酒多以根霉菌、黃酒酵母作為發酵劑，青稞中的多酚成分也大多損失，并沒有在青稞酒中較好地保留下來。

紅曲霉中含有包括糖化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等各種酶類，在發酵過程中能代謝產生γ - 氨基丁酸、紅曲色素、洛伐他汀等多種活性物質[7-8]。有研究表明，紅曲霉產生的水解酶可以破壞細胞壁結構，斷裂酚類物質與其他物質相互作用的化學鍵，促進植物基質或者谷類食品多酚類活性成分的釋放，并且在大豆、燕麥、薏米、大麥等谷物的研究中已有相關報道[9-12]，也有研究證明了紅曲霉發酵能夠有效提高酒體的多酚含量和抗氧化活性[13-14]，但是將紅曲霉菌應用于發酵高原特色的青稞酒的相關研究未見報道，因此進行紅曲霉固態發酵青稞酒工藝研究對豐富青稞發酵產品、推動青稞產業發展具有重要意義。以青稞為原料，對青稞籽粒進行前處理，通過紅曲霉固態發酵青稞酒，以多酚質量濃度、黃酮質量濃度、酒精度和感官評分作為主要評價指標，優化富含酚類物質的紅曲青稞酒發酵的工藝參數，并對其抗氧化活性進行研究，為青稞低度酒的開發及產業化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

ACCC 30352 紫紅曲霉，上海瑞楚生物科技有限公司菌種保藏中心（RCCC） 提供；昆侖20 號青稞、昆侖15 號青稞米，青海省農林科學院作物所提供；安琪甜酒曲，湖北安琪酵母股份有限公司提供；食用檸檬酸，濰坊英軒實業有限公司提供；食用小蘇打，山東圣琪生物有限公司提供。

1.2 試驗設備

SX-500 型蒸汽滅菌器，日本TOMY KOGYO 公司產品；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；THZ-98AB 型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司產品；LRH-150 型生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司產品；FW 100 型高速萬能粉碎機，上海科恒實業發展有限公司產品；DL-5M 型低速冷凍離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；SHB-III 型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司產品；R-210 型旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI 公司產品；N4S 型紫外線可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；SGD- IV型全自動還原糖測定儀，中國遼寧塞亞斯科技有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 青稞紅曲米制作工藝流程

（1） 麥芽汁瓊脂固體培養基配方。麥芽汁培養基質量濃度131.0 g/L，瓊脂粉質量濃度15 g/L。

（2） 種子液配方。葡萄糖用量6.0 g，蛋白胨用量0.5 g，磷酸二氫鉀用量0.25 g，硝酸鈉用量0.3 g，硫酸鎂用量0.1 g，蒸餾水用量100 mL。

（3） 菌懸液。自培養平板中勾取5 環菌絲接入50 mL 無菌生理鹽水中，于28 ℃下以轉速180 r/min恒溫振蕩1.5 h。

（4） 種子液。將100 mL 種子液裝于250 mL 錐形瓶中，于121 ℃下高壓滅菌20 min，冷卻至室溫后，用移液槍（使用高壓蒸汽滅菌的槍頭） 取5 mL菌懸液，移入種子液培養基中，于28 ℃下以轉速180 r/min 恒溫振蕩培養63 h，即得種子液，用于接種發酵培養基。

1.3.2 紅曲霉固態發酵青稞酒工藝流程

（1） 預處理方式的篩選。①不同脫皮層數青稞原料的篩選。分別取50 g 未脫皮、脫皮1 次、脫皮2 次、脫皮3 次、脫皮4 次的昆侖15 號青稞米作為原料，洗凈后以3 倍質量的蒸餾水浸泡12 h，洗凈瀝水后，加入1.2 倍蒸餾水，封口膜封口后于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后拌入10%紅曲粉和1%安琪甜酒曲共同發酵，25 ℃下發酵1 d 后轉入28 ℃發酵。5 d 后取發酵液測定還原糖含量，篩選出最優脫皮層數。②不同紅曲米處理方式的篩選。粉曲處理，稱量5 g 青稞紅曲米用萬能粉碎機粉碎15 s，間歇5 s，重復粉碎3 遍。浸曲處理，稱量5 g 青稞紅曲米至三角瓶中，加入無菌溫水20 mL，攪勻，28 ℃下保溫浸泡12 h，此時青稞紅曲多數浮起，表面有小氣泡（發酵現象），略有輕微酒氣。采用加曲發酵前12 h 預浸紅曲，有利于紅曲中酶類物質大量溶出，加速液化，提高糖化速度。以篩選出的青稞米作為發酵基物，分別加入粉曲處理和浸曲處理的紅曲作為發酵劑，進行發酵，并通過測定前發酵過程中液體發酵物中的還原糖含量篩選出最優的原料處理方式。

（2） 紅曲霉固態發酵青稞酒工藝優化。在傳統半干型黃酒釀造工藝的基礎上，設計單因素試驗，以感官評定、酒精度、氨基酸態氮及多酚、黃酮類物質為指標，確定紅曲霉固態發酵青稞酒的料液比、加曲量、初始發酵pH 值、發酵溫度及發酵時間等工藝條件。進行單因素試驗和正交試驗，優化釀造條件。①單因素試驗設計。以每個單因素試驗的最優結果進行下一單因素試驗。②正交試驗設計。在單因素試驗基礎上，設計四因素三水平正交試驗L9（34）工藝條件。

單因素試驗設計見表1，正交試驗因素與水平設計見表2。

表1 單因素試驗設計

表2 正交試驗因素與水平設計

1.3.3 青稞紅曲酒質量評價

（1） 感官品質評價標準。感官品質評價在品酒室中進行，品酒室要求光線充足、柔和、適宜，溫度20～25 ℃，空氣新鮮，無香氣及邪雜氣味。感官評定參考GB/T 13662—2018《黃酒》中傳統型半干黃酒的感官要求。

青稞紅曲酒感官要求見表3。

表3 青稞紅曲酒感官要求

（2） 酒精度、總酸、氨基酸態氮、還原糖、總糖等理化指標的測定參照GB/T 13662—2018《黃酒》。

（3） 總黃酮含量的測定。參考黃丹丹等人[15]的測定方法，繪制蘆丁標準曲線，得到線性回歸方程：Y=0.007 7X-0.051 9，R2=0.998。①樣品的制備。移取1 mL 酒液至10 mL 容量瓶中，以濃度為0.1 mol/L的NaOH 溶液調pH 值至中性，再多加2 滴，水定容至刻度，搖勻，備用。②樣液測定。取2 mL 樣液4 等份，置于10 mL 具塞試管中，加入質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min，加入質量分數為0.3 mL 10%硝酸鋁溶液（以不加硝酸鋁作為空白），靜置 6 min，加入質量分數為4%的氫氧化鈉溶液2 mL，混勻后，以體積分數30%的乙醇定容，放置15 min 后測定波長510 nm 處吸光度。

（4） 總酚含量的測定。參考黃丹丹等人[15]的測定方法，繪制沒食子酸標準曲線，得到線性回歸方程：Y=0.016 4X-0.038 4，R2=0.998。樣液測定：試驗組加酒液0.05 mL，去離子水4.95 mL，以水作空白，分別加入福林酚0.5 mL，充分搖勻后加入7.5%碳酸鈉溶液1 mL，于45 ℃下反應15 min，于波長765 nm處測吸光度，平行測定3 次。

（5） 抗氧化指標測定。參考楊希娟等人[16]的方法。①清除DPPH·自由基活性測定。吸取酒液50 μL于試管中，再加入濃度為0.1 mmol/L 的DPPH·甲醇溶液4.5 mL，充分搖勻后避光反應30 min，以無水甲醇代替提取液作空白調零，于波長517 nm 處測定吸光度，平行測定3 次。②清除ABTS 自由基活性測定。吸取酒液20 μL 于試管中，再加入ABTS 自由基工作液4 mL，充分搖勻后避光反應30 min，以無水甲醇代替提取液作空白調零，于波長734 nm 處測定吸光度，平行測定3 次。③FRAP 鐵還原能力測定。吸取酒液50 μL 于試管中，再加入FRAP 工作液4.5 mL，充分搖勻后避光反應30 min，以無水甲醇代替提取液作空白調零，于波長593 nm 處測定吸光度，平行測定3 次。

1.4 數據分析

所有的試驗數據都是3 次試驗的平均值，應用Excel 和SPSS-26 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 預處理方式篩選結果

2.1.1 不同脫皮層數青稞原料的篩選

脫皮層數對前發酵還原糖含量的影響見圖1。

圖1 脫皮層數對前發酵還原糖含量的影響

由圖1 可知，隨著脫皮層數的增多，紅曲霉發酵青稞產生的還原糖呈現先增多后減少的趨勢。脫皮3 次的青稞經發酵后還原糖含量最高為6.21%。這可能是由于脫皮去除了部分青稞堅硬的穎殼，使得紅曲霉菌及根霉菌可充分與青稞胚乳接觸，生長繁殖并分泌水解酶系，將淀粉和纖維素等大分子物質分解為可供微生物生長的葡萄糖[16-17]，促進微生物的快速生長和發酵，由此產生的正反饋系統為后期酒精發酵提供了充足的碳源反應物。當青稞米進行4 次脫皮處理時，發酵前期產生的還原糖含量下降，這可能與青稞的過度碾磨、糊粉層和亞糊粉層被完全剝離、胚乳層的淀粉顆粒受到磨損有關。

2.1.2 不同紅曲米處理方式的篩選

紅曲米預處理方式對前發酵還原糖含量的影響見圖2。

圖2 紅曲米預處理方式對前發酵還原糖含量的影響

由圖2 可知，粉曲處理組紅曲霉發酵青稞產生的還原糖質量濃度要顯著高于浸曲處理組（p＜0.05）。相較于浸曲處理，粉碎處理使紅曲與青稞物料混合更加均勻，紅曲霉能夠充分依附在青稞表層，迅速地向內生長繁殖，分解胚乳中的淀粉組織，釋放出還原糖。而且，在實際生產過程中，浸曲處理在投入生產時不便控制，極易引發雜菌侵染，不如粉曲使用時便捷可控，因此以粉碎處理的紅曲作為發酵劑更加有利于后期的酒精發酵。

2.2 紅曲霉固態發酵青稞酒工藝優化

2.2.1 料液比對紅曲霉發酵青稞酒的影響

料液比對青稞酒品質的影響見圖3。

圖3 料液比對青稞酒品質的影響

由圖3 可知，隨著料液比變小，發酵后青稞酒中的多酚、黃酮質量濃度和酒精度呈現出先增大后減小的趨勢，在料液比為1∶1.5（g∶mL） 時達到最高，而酒體的感官評分隨著料液比的增大持續降低。這可能是因為較高的料液比使發酵液中總糖含量偏高，青稞酒滋味更加香醇；加水量少和粉曲處理形成的高滲環境抑制了紅曲霉菌和根霉菌的生長繁殖，發酵不充分，酒精度偏低，青稞中的多酚和黃酮成分也難以釋放；而隨著料液比降低，蒸熟后青稞的黏性增強，高黏環境使青稞基料中透氧量大幅下降，紅曲霉和根霉生長受阻，發酵后期更容易受到雜菌侵染，成品酒發酸發澀，感官品質變差。因此，綜合考慮酒精度、感官指標和功能性多酚類物質的質量濃度，確定最佳料液比為1∶1.2（g∶mL）。

2.2.2 加曲量對紅曲霉發酵青稞酒的影響

加曲量對青稞酒品質的影響見圖4。

由圖4 可知，隨著加曲量增大，青稞酒的酒精度和感官評分先增大后趨于平緩，總酚質量濃度先增大后減小，黃酮質量濃度略有減少。加曲量對青稞酒的影響是直觀可視的，隨著加曲量的增加，青稞酒越發紅潤透亮，感官評分增大；當加曲量較低時，紅曲霉產生的蛋白酶無法充分分解青稞中的蛋白質，發酵前蛋白質大量殘留，促使發酵時細菌過度繁殖產酸[18-19]，青稞酒口感酸澀；但加曲量過高，紅曲霉大量生長抑制了根霉菌的活性，2 種菌的協同發酵效果變差，紅曲特征過于濃厚，會使青稞酒口感發澀，損害青稞酒的整體協調性；且紅曲霉的過度生長，會導致后發酵底物不足，加速酸類物質積累，抑制多酚類物質的產生。當加曲量為15%時，酒體中總酚質量濃度最高為1 457.20 mg/L，此時青稞酒色澤明麗氣味芳香，酒體的酒精度最高，感官評分達69.11 分。

2.2.3 初始發酵pH 值對紅曲霉發酵青稞酒的影響

初始發酵pH 值對青稞酒品質的影響見圖5。

由圖5 可知，相較于中性環境，較低的初始發酵pH 值更有利于酒精發酵和多酚組分的釋放，隨著初始發酵pH 值的增大，酒體中的總酚質量濃度和酒精度都呈現出先增加后降低的趨勢，黃酮質量濃度基本保持穩定，但在初始發酵pH 值為6 時，酒體中黃酮質量濃度突然降低，這可能與中性環境下受到雜菌侵染有關。當初始發酵pH 值為3.5～5.0 時，酸性環境有效地抑制了雜菌的生長，保證有益菌的大量繁殖，紅曲菌產生大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶系，將與多糖或蛋白通過酯鍵和醚鍵的形式連結的結合酚釋放出來[20-21]；在初始發酵pH 值為4 時，紅曲酒總酚質量濃度最高為1 602.32 mg/L，酒精度達到9.4%Vol，青稞酒醇香濃郁，感官評分最高達68.33 分，確定最佳初始發酵pH 值為4。

2.2.4 發酵溫度對紅曲霉發酵青稞酒的影響

發酵溫度對青稞酒品質的影響見圖6。

圖6 發酵溫度對青稞酒品質的影響

由圖6 可知，隨著發酵溫度的提高，青稞酒中的總酚、黃酮質量濃度和酒精度先升高后降低。在29 ℃時，黃酮質量濃度和酒精度達到最高，但酒體中的總酚質量濃度低于32 ℃發酵酒。高溫能夠有效釋放青稞中的功效成分及芳香物質，但當發酵溫度高于29 ℃時，微生物在發酵初期產生大量的呼吸熱，使發酵液溫度急劇升高，達到36 ℃以上，過度的高溫可能會使紅曲霉提前老化，導致發酵不徹底，酒精度降低[22]，甚至使發酵液污染其他霉菌，影響成品酒的感官品質。因此，最適發酵溫度應控制為29 ℃。

2.2.5 發酵時間對紅曲霉發酵青稞酒的影響

發酵時間對青稞酒品質的影響見圖7。

圖7 發酵時間對青稞酒品質的影響

由圖7 可知，隨著發酵時間延長，酒體中的多酚和黃酮質量濃度都呈現出先增加后降低的趨勢，酒精度則是隨著發酵程度的加深逐漸增大，到發酵后期保持穩定。青稞酒釀造時發酵時間過短會使發酵不充分，糖類物質不能充分轉化為酒精，影響酒體的品質，發酵時間過長，營養物質過度消耗，不利于紅曲霉的生長繁殖，代謝產生不良產物，使酒變得渾濁，且易受到雜菌污染，酒體發酸。當發酵時間為15 d 時，紅曲酒的總酚和總黃酮質量濃度分別為1 489.51 mg/L 和105.06 mg/L，高于其他發酵組，酒精度為9.6%Vol 達到最高。因此，確定紅曲霉固態發酵青稞酒的時間為15 d。

2.2.6 正交試驗結果

正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 正交試驗結果

表5 方差分析結果

由表4 和表5 可知，影響青稞酒中黃酮質量濃度的因素主次順序為B＞A＞C＞D，其中加曲量對青稞酒中的黃酮質量濃度具有顯著影響（p＜0.05），料液比和發酵溫度對酒體中的黃酮質量濃度影響較小。此時，紅曲霉固態發酵青稞酒的最優工藝條件為A2B1C1D1，即料液比1∶1.2（g∶mL），加曲量12.5%，發酵溫度27 ℃，發酵時間14 d。

影響青稞酒中總酚質量濃度的因素主次順序為C＞A＞B＞D，其中發酵溫度對酒體中的多酚質量濃度影響較顯著（p＜0.05），料液比和加曲量影響較小。此時，紅曲霉固態發酵青稞酒的最優工藝條件為A1B2C1D3，即料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，發酵溫度27 ℃，發酵時間16 d。

影響青稞酒中酒精度的因素主次順序為C＞B＞D＞A，其中發酵溫度、加曲量、發酵時間和料液比對酒體中的酒精度影響均不顯著（p＞0.05）。此時，紅曲霉固態發酵青稞酒的最優工藝條件為A2B2C1D2，即料液比1∶1.2（g∶mL），加曲量17.5%，發酵溫度27 ℃，發酵時間15 d。

影響青稞酒感官評分的因素主次順序為C＞A＞D＞B，其中發酵溫度對酒體中的感官評分影響較顯著（p＜0.05），料液比、發酵時間和加曲量影響不顯著（p＞0.05）。此時，紅曲霉固態發酵青稞酒的最優工藝條件為A1B2C1D3，與總酚質量濃度條件下的最優工藝一致。

2.2.7 驗證試驗

根據正交試驗結果，選取高黃酮質量濃度組合A2B1C1D1，高總酚質量濃度和高感官評分組分A1B2C1D3，高酒精度組分A2B2C1D2進行驗證試驗。

驗證試驗結果見表6。

表6 方差分析結果

由表6 可知，在3 組驗證試驗中，A1B2C1D3組合的成品酒中總酚質量濃度為1 823.31 mg/L 顯著高于其他2 個組合，此時青稞酒的黃酮質量濃度為127.00 mg/L，感官評分為82.2 分，達到最高，酒精度為8.53%Vol，略低于A2B2C1D2組合，說明此工藝條件下制備的青稞酒具有較強的抗氧化活性。A1B2C1D3組合的青稞酒中FRAP 鐵還原能力、ABTS·清除能力和DPPH·清除能力分別為2 000.50 μmol/L，5 577.00 μmol/L 和1 202.11 μmol/L。因此，確定紅曲霉固態發酵青稞酒的最優工藝條件為A1B2C1D3組合，即料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，發酵溫度27 ℃，發酵時間16 d。

3 結論

青稞脫皮的層數及紅曲米粉碎的方式等均對青稞紅曲酒品質有一定的影響。結果表明，以3 次脫皮的青稞為原料，接種紅曲粉、甜酒曲進行固態發酵，青稞紅曲酒的發酵工藝為料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，發酵溫度27 ℃，發酵時間16 d。在此優化條件下，青稞酒的總酚質量濃度為1 823.31 mg/L，黃酮質量濃度為127.00 mg/L，酒精度為8.5%Vol，感官評分為82.2 分，DPPH·清除能力為1 202.11 μmol/L，ABTS·清除能力為5 577.00 μmol/L，FRAP 鐵還原能力為2 000.50 μmol/L。青稞酒產品色澤紅潤清透，酒體芳香濃郁、醇厚細膩、營養豐富，生物活性成分多酚質量濃度顯著高于傳統青稞酒，具有較強的抗氧化活性。