SKA3在食管鱗狀細胞癌中表達及其與臨床病理參數的關系

林思彤,陳罡,羅文奇,陳肖瑜,潘如冰,張鳳友

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院病理科,廣西南寧 530021;2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院病理科,廣西南寧 530021)

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一。在2020年全球癌癥統計中顯示,食管癌新發病例約為60萬,死亡病例約54萬[1],而中國是全球食管癌發病率較高的國家之一[2]。因此,深入探討食管癌的發生發展機制具有重要意義。紡錘體與著絲粒相關蛋白3(spindle and kinetochore associated protein 3,SKA3/C13orf3)是SKA蛋白復合體的重要組成部分,是一種促進腫瘤惡性轉化的新基因,其過表達與多種腫瘤的發生發展密切相關[3-4]。SKA3生物功能主要是參與調節染色體的分離以及有絲分裂過程中著絲粒的定位[5]。在前期研究中,我們首次報道了甲狀腺乳頭狀癌中SKA3蛋白的表達及臨床意義[6]。然而目前在食管癌相關文獻中尚無SKA3基因的研究報道。本研究通過大數據隊列研究及免疫組織化學染色實驗,分析了SKA3基因在食管鱗狀細胞癌中的表達意義及其與臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集本研究收集了廣西醫科大學附屬腫瘤醫院2018年6月至2022年3月期間行食管癌根治術切除的手術標本,其中包含75例食管鱗狀細胞癌和配對的20例正常食管組織。本研究經過廣西醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會審批,所有患者均已簽署知情同意書(LW20222092)。

1.2 免疫組織化學染色免疫組織化學染色采用通用SP試劑盒(鏈霉卵白素-生物素法檢測系統)(北京中杉金橋公司,#SP-9000型);一抗：SKA3抗體(北京博奧森公司,#bs-7848R,1∶400稀釋)。免疫組化實驗步驟按照SP-9000試劑盒說明書執行,采用枸櫞酸抗原修復液直接水浴修復,采用DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司,ZLI-9017)顯色。免疫組化染色結果判讀：根據陽性染色的腫瘤細胞百分數打分：“0%”代表0分,“<10%”代表0分,“11%～25%”代表1分,“26%～50%”代表2分,“51%～75%”代表3分,“76%～100%”代表4分。染色強度：“0”(陰性),“1”(細胞質呈淺黃色),“2”(細胞質呈棕黃色),“3”(細胞質呈棕褐色)。免疫組化染色最終得分根據腫瘤細胞陽性表達百分數和染色強度的乘積計算得出。樣本得分大于4分為高表達,小于等于4分為低表達。

1.3 樣本隊列數據來源公共隊列樣本數據來自腫瘤基因組圖譜(TCGA) (https：//portal.gdc.cancer.gov) 的食管鱗狀細胞癌隊列數據,該隊列包含109例(腫瘤96例、正常對照13例)的mRNA測序數據和患者臨床參數數據。基因芯片GSE23400(腫瘤51例、正常樣本51例)、GSE45670(腫瘤28例、正常樣本10例)及GSE161533(腫瘤28例、正常樣本28例)的隊列數據來自(GEO)數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)(27008011)。

1.4 數據分析通過卡方檢驗分析SKA3蛋白在ESCC中表達水平及其與臨床病理參數的關系。Linkedomics(http：//www.linkedomics.org/login.php)軟件篩選與SKA3共表達的正或負相關基因。DAVID軟件對共表達基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO) 富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路分析。GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn) (28407145)軟件分析SKA3 mRNA在多種常見惡性腫瘤中的表達以及在食管癌中表達與細胞周期關鍵調控蛋白CCND1、CDK1及CDK4的相關關系。

1.5 統計學方法利用SPSS 20.0軟件進行統計學分析,卡方檢驗分析免疫組化SKA3蛋白在食管癌中高表達組和低表達組之間的統計學意義。t檢驗分析SKA3基因的表達在TCGA-ESCA隊列和GEO高通量芯片隊列中腫瘤組和正常對照組間的統計學意義。Spearman法篩選SKA3的共表達正負相關基因,篩選標準為：P<0.05,r>0.4或<-0.4。Spearman法分析SKA3與細胞周期調控蛋白的相關性。

2 結 果

2.1 SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達免疫組化染色顯示SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞質中呈棕黃色,如圖1所示。相較于正常食管組織,SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中顯著高表達(χ2=18.424,P<0.001)。見表1。

A：SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌中高表達,細胞質呈棕黃色(IHC);B：SKA3蛋白在正常食管上皮組織幾乎不表達(IHC)

表1 SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌與癌旁正常組織中的表達[n(%)]

2.2 SKA3 蛋白與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的關系SKA3蛋白在食管低分化癌中表達增高(P<0.05)。比較不同特征 ESCC 患者 SKA3 高表達率,即神經侵犯患者SKA3 高表達率高于無神經侵犯患者(P<0.05)。在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組中SKA3 表達高于Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)。不同年齡、性別、腫物大小、浸潤深度、淋巴結轉移、癌栓浸潤及腫瘤位置的 ESCC 患者 SKA3 蛋白高表達率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 SKA3蛋白的表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理參數的關系[n(%)]

續表2

2.3 SKA3 mRNA在食管癌中的表達從TCGA數據庫和GEO中獲取4個隊列共 203例食管鱗狀細胞癌及102例正常對照組織的SKA3 mRNA表達數據,分別為TCGA-ESCC[癌(2.752±0.071),正常(0.991±0.238)]、GSE23400[癌(2.828±0.007),正常(2.775±0.008)]、GSE45670[癌(8.642±0.064),正常(7.628±0.326)]、GSE161533[癌(5.899±0.055),正常(5.561±0.042)]。結果顯示,與正常食管組織相比,SKA3 mRNA在食管鱗狀細胞癌均表達上調,差異有統計學意義(P均<0.001)。見圖2。

A：TCGA數據庫隊列;B：GEO數據庫GSE23400;C：GEO數據庫GSE45670;D：GEO數據庫GSE161533

2.4 食管癌中SKA3基因的共表達基因及其功能分析通過Linkedomics在線軟件篩選食管癌中與SKA3基因共表達的相關基因。獲得與SKA3共表達的基因772個,其中正相關基因567個(P<0.05,r>0.4) ,負相關基因205個(P<0.05,r<0.4)。GO富集分析顯示,以上正相關共表達基因參與：細胞分裂、細胞周期、有絲分裂等生物學過程(biological process, BP);細胞成分(cellular component, CC)主要富集于細胞漿、細胞核形成、著絲粒組成等;分子機制(molecular function,MF)方面主要參與結合蛋白質、poly(A) RNA 結合、ATP結合等。KEGG通路分析顯示這些基因主要富集在：DNA復制、細胞周期、范科尼貧血(Fanconi anemia)通路、基因錯配修復、核酸剪接體等路徑。

2.5 食管癌中SKA3基因表達與細胞周期調控基因的關系如圖3示：在食管癌中SKA3基因的表達與細胞周期調控基因CCND1(r=0.17,P=0.015)、CDK1(r=0.71,P<0.001)及CDK4(r=0.52,P<0.001)均呈正相關,差異均有統計學意義。

A：SKA3與CCND1呈正關性;B：SKA3與CDK1呈正關性;C：SKA3與CDK4呈正關性

3 討 論

許多研究證實,SKA3在細胞增殖、侵襲、遷移及腫瘤發生等過程中發揮重要作用,在多種惡性腫瘤中表達上調[7-10]。基于TCGA數據庫,我們發現SKA3在諸如乳腺癌、肺腺癌、胃腺癌、結腸腺癌及腦膠質母細胞瘤等中均為高表達。在本研究中,我們首次通過TCGA及GEO大樣本的生物信息數據庫,提取了4組獨立的ESCC的隊列數據,分析SKA3 mRNA在食管鱗狀細胞癌及食管正常組織中的表達,發現SKA3 mRNA在食管鱗狀細胞癌中表達上調。進一步對課題組收集的組織進行免疫組織化學染色,結果顯示SKA3蛋白在食管鱗狀細胞癌中亦顯著高表達,免疫組化蛋白表達結果與我們采集的4個生物信息表達隊列的結果一致,支持SKA3在食管鱗狀細胞癌中高表達的結論。SKA3蛋白在晚期食管鱗狀細胞患者中的表達顯著高于早期患者,且分化越差,有神經侵犯的患者中SKA3蛋白表達越高,這均說明SKA3可能與食管鱗狀細胞癌的進展和復發有關。以上結果提示我們,SKA3基因在食管鱗狀細胞癌的發生進展中具有重要作用。

共表達基因的GO功能富集分析顯示,多種生物學進程和通路與SKA3基因相關。我們發現SKA3基因參與細胞分裂、細胞周期、有絲分裂等多種重要的生物學過程。研究表明,SKA3蛋白是紡錘體和著絲粒相關蛋白復合體的重要組成亞基,其主要功能是確保有絲分裂中精確的染色體分離和穩定微管-動粒的活動,敲除SKA3可激活紡錘體裝配檢查點,姐妹染色單體失去黏附,導致中期有絲分裂停止[11-12]。SKA3通過NDC80復合物控制和調控有絲分裂,也調控細胞增殖和凋亡。SKA3潛在作用介導了腫瘤細胞周期和進展[13]。HOU等研究者發現,在肝細胞癌中SKA3可通過激活周期蛋白CDK2/P53磷酸化促進腫瘤細胞的增殖[14]。此外,SKA3還可以通過阻止PLK1蛋白的降解影響乳腺癌細胞的生長[10],并通過激活EGFR-PI3K-Akt通路促進肺腺癌細胞的轉移[15]。更有趣的是,研究還發現靶向SKA3可影響PLK1-Akt通路軸心調控糖代謝抑制喉癌的化療抵抗[16]。ZHAO等[17]研究表明,circ-SKA3作為癌基因通過誘騙miR-326增加髓母細胞瘤的表達,從而促進髓母細胞瘤的發展。SKA3可能通過細胞周期、DNA損傷、激素雄激素受體、激素雌激素受體、PI3K/Akt、Ras/MAPK等因素影響腎乳頭狀細胞癌預后不良[18]。我們通過KEGG分析發現SKA3主要參與DNA復制、細胞周期、基因錯配修復等分子通路。相關分析表明SKA3與細胞周期調控因子CCND1、CDK1及CDK4存在正相關關系。SKA3與CDK1的磷酸化對于有絲分裂過程中SKA復合物的著絲點定位至關重要,基因相互作用通過調控細胞周期促進細胞增殖[14]。綜上結果表明SKA3作為SKA家族的重要成員,參與了細胞周期的調控,可能是通過影響細胞周期蛋白調控細胞周期進程,在腫瘤的形成和增殖中發揮重要作用。而SKA3在食管鱗狀細胞癌中的促癌機制研究仍需大量的體內外實驗的佐證。

總之,本研究通過大數據庫的篩選和免疫組化實驗驗證,證實SKA3在食管鱗狀細胞癌中顯著高表達,SKA3高表達可能與食管鱗狀細胞癌發生發展密切相關,并可能通過調控細胞周期進程而促進腫瘤的進展,這為食管癌的發生發展分子機制研究提供了新思路。