TP 法與CAP 法測定食品微生物菌落總數(shù)的效果對比

王佳敏

（烏蘭察布市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

食品安全監(jiān)管是國家公共衛(wèi)生管理的重要工作，食品衛(wèi)生檢測是其中不可或缺的一環(huán)，食品中農(nóng)藥殘留、重金屬、微生物的檢測都屬食品衛(wèi)生檢測重點(diǎn)。在食品安全檢測中，采取有效測定方法確定微生物群落總數(shù)以及類型，能夠幫助檢測部門掌握食品中微生物的生長繁殖情況，從而判定食物的儲(chǔ)存環(huán)境，推斷食物的新鮮程度和污染程度，幫助食品安全監(jiān)管部門判斷目標(biāo)食品在生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售等過程中是否符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，通過采取有效措施避免食品安全問題[1]。在當(dāng)前食品微生物菌落測定手段與方法中，測試片法（Test Piece Method，TP）與計(jì)數(shù)瓊脂平板法（Counting Agar Plate Method，CAP）均被廣泛應(yīng)用，兩種測定方法各具優(yōu)劣，本研究將對比兩種測定辦法的實(shí)際測定效果。

1 材料與方法

1.1 樣品與材料

選取2021 年6 月至2022 年6 月疾控中心收集的食品樣品共計(jì)80 份作為研究對象，所有樣品同時(shí)接受CAP 法與TP 法檢測。測試紙片法選擇廣東達(dá)元綠洲公司的“食品、飲用水菌落測定試紙片”，產(chǎn)品購置后存放于冰箱中，保存溫度4 ～10 ，測試紙片應(yīng)符合GB 4789.2—2022 要求，符合美國AOACOMA 標(biāo)準(zhǔn)986.33、990.12。培養(yǎng)基選擇上海康潤生物科技有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂成品，按要求配置、滅菌后備用。

1.2 方法

開展實(shí)驗(yàn)之前，嚴(yán)格按照研究標(biāo)準(zhǔn)落實(shí)無菌規(guī)則，對于涉及的實(shí)驗(yàn)器材、試劑均嚴(yán)格落實(shí)消毒標(biāo)準(zhǔn)，檢測過程中用到的儀器及設(shè)備應(yīng)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行使用。針對液體樣品，用滅菌吸管準(zhǔn)確吸取25 mL 樣品加入225 mL 蒸餾水或生理鹽水及有關(guān)檢驗(yàn)的增菌液中，制成1 ∶10 的稀釋液。吸取前要將樣品充分混合，取樣的吸管插入樣品的深度一般不要超過25 mm；處理固體樣品，將100 g 或100 g 以上的樣品剪碎混勻，取25 g 放入無菌乳缽中充分研磨后再放入帶有225 mL 無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。樣品處理完成后，適量與無菌磷酸緩沖液混合均勻，按照梯度進(jìn)行10、100、1 000、10 000 倍數(shù)稀釋，作為稀釋液備用。

1.2.1 TP 法

菌落總數(shù)測試用紙是一種提前制備好的一次性培養(yǎng)基產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有標(biāo)準(zhǔn)的營養(yǎng)培養(yǎng)基，檢測到菌落時(shí)測試片會(huì)呈現(xiàn)紅色。TP 法操作步驟：①樣品處理完成后，將菌落總數(shù)測試片平攤于臺(tái)面上，隨后按照試紙操作步驟撕開上層膜，無菌吸管規(guī)范吸取樣品1 mL，正確滴加在試紙上，蓋上上層膜，完成后靜置10 s，每個(gè)稀釋度均接種2 片，做好空白對照；②培養(yǎng)，試紙回收疊加，放回自封袋，將透明面朝上，放置于37 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h；③結(jié)果分析，觀察測試紙片上是否會(huì)生長紅色斑點(diǎn)，以菌落總數(shù)適中的測試片為常規(guī)對象，進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，隨后計(jì)算細(xì)菌菌落的總數(shù)。

1.2.2 CAP 法

CAP 法操作步驟：①無菌吸管規(guī)范吸取1 mL 稀釋液，放在滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度應(yīng)保證不少于2個(gè)平行樣，避免出現(xiàn)誤差；②充分等待培養(yǎng)皿營養(yǎng)瓊脂冷卻，培養(yǎng)皿在制作過程中46 恒溫保溫，在凝固后翻轉(zhuǎn)放置，培養(yǎng)48 h，同時(shí)做好空白對照。③在培養(yǎng)完成后，取出培養(yǎng)皿，計(jì)算菌落總數(shù)，菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)，得到所含菌落總數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察指標(biāo)包括總菌落數(shù)及檢出超標(biāo)率、大腸桿菌菌落數(shù)及檢出超標(biāo)率、霉菌菌落數(shù)及檢出超標(biāo)率。

超標(biāo)率=（超標(biāo)個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)）×100%，檢出數(shù)與超標(biāo)率越高，測定效果越好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將數(shù)據(jù)納入SPSS 23.0 軟件中分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，并以（±s）表示，率計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，并以率（%）表示，P＜0.05 為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

CAP 組總菌落數(shù)數(shù)量及檢出超標(biāo)率、大腸桿菌與霉菌菌落數(shù)量及檢出超標(biāo)率高于TP 組，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 大腸桿菌與霉菌菌落數(shù)量及檢出超標(biāo)率

3 結(jié)論與討論

食品微生物檢驗(yàn)工作通常會(huì)對樣品中的微生物采取分離培養(yǎng)、生理生化反應(yīng)以及顯微鏡檢查等方式來分析并確定菌落數(shù)量和種類，相關(guān)情況的分析對于食品的生產(chǎn)、加工、存儲(chǔ)以及售賣等過程的食品安全管理有重要意義。在食品微生物測定中，菌落是在細(xì)菌培養(yǎng)之后生長繁殖在固體培養(yǎng)基上且能夠用肉眼觀察清楚的生長物，不同的菌落培養(yǎng)與檢測方法廣泛應(yīng)用于食品微生物的檢測當(dāng)中。

本研究中所對比的TP、CAP 檢測方法在各級(jí)檢測部門中較為常見，發(fā)揮不同作用。測試紙片法（TP）因其快速鑒定的優(yōu)點(diǎn)[2]，被食品管理部門用作食品快速檢測。該方法快速便捷，在實(shí)際操作中，檢測人員需要通過食品樣品的收集處理，經(jīng)過科學(xué)規(guī)范的操作，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)明確食品中一種或多種菌種的數(shù)量。TP 法能夠滿足食品檢驗(yàn)部門對市面流通食品進(jìn)行快速檢測的要求，進(jìn)一步提高食品樣品檢驗(yàn)的速度與精度。計(jì)數(shù)瓊脂平板法（CAP）則是實(shí)驗(yàn)室常見的食品微生物檢測方法，廣泛用于食品、化妝品和飲用水中微生物計(jì)數(shù)，該方法較TP 法能夠獲得更加準(zhǔn)確的檢測結(jié)果[3]，但實(shí)際結(jié)果受到較多因素影響，包括營養(yǎng)條件、溫度、時(shí)間、pH 值等，若相關(guān)條件控制不好，則可能導(dǎo)致菌群不能有效繁殖[4]。因此在實(shí)際的食品樣品檢驗(yàn)工作中，CAP 檢測需要注意諸多問題。例如，需要控制好溫度的變化、要確保培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂與樣品充分混合、有不明沉淀物存在于培養(yǎng)基底部時(shí)要避免將沉淀物倒入傾注皿當(dāng)中[5]。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAP 法的檢出總菌落數(shù)及超標(biāo)率、檢出大腸菌群落數(shù)及超標(biāo)率、檢出霉菌菌落數(shù)及超標(biāo)率均高于TP 法，但組間對比差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這與陳怡文等[6]的研究結(jié)果一致，兩種方法各具優(yōu)勢與缺陷，但綜合而言TP 法適用性更高。TP 法檢測過程簡便，省略了培養(yǎng)基配置、瓊脂高壓滅菌以及傾注冷卻、等候瓊脂凝固等步驟，減少了檢測所需時(shí)間，對于食品微生物檢測工作而言能節(jié)省時(shí)間成本。TP 檢測法主要材料為薄紙片，而CAP 法一個(gè)稀釋梯度則需要2 個(gè)平行，針對同一樣品菌落總數(shù)的檢測需要進(jìn)行多個(gè)濃度梯度稀釋，需使用多個(gè)平板，若樣品過多，需購買較多培養(yǎng)箱，且培養(yǎng)平板所占空間需求較大，這對空間有限的檢測機(jī)構(gòu)而言并不方便，因此TP 法十分適合培養(yǎng)場地小、檢測樣品數(shù)量多的檢測機(jī)構(gòu)使用。同時(shí)，TP 法中培養(yǎng)基為預(yù)制備，不需人工制備，有效減少了人為因素對測定結(jié)果的影響[7]。此外，TP 法中紙片可降解，不會(huì)產(chǎn)生其他污染物品（如廢液廢物），能避免對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害，且試驗(yàn)結(jié)束后清洗工作量較少，這也是國外FDA、AOAC 官方方法、加拿大等均廣泛將TP 法用于食物、空氣、環(huán)境中菌落總數(shù)檢測以及監(jiān)控工作的關(guān)鍵原因[8]。但需注意的是，盡管TP 方法具有更多的優(yōu)勢，但從結(jié)果可見菌落數(shù)量與檢出超標(biāo)率低于CAP 法，可能原因是TP 法準(zhǔn)確性辨識(shí)度低，不利于觀察，且氧氣條件控制受到一定限制[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過嚴(yán)密監(jiān)測試驗(yàn)階段中各階段的半成品，實(shí)施過程質(zhì)控有助于提高檢測質(zhì)量，未來還應(yīng)深入研究并投入實(shí)踐，以提高食品安全監(jiān)測水平。

綜上所述，在食品微生物菌落測定中，CAP 法檢出效果綜合而言優(yōu)于TP 法，CAP 法檢出數(shù)量、準(zhǔn)確性均略高于TP 法，但CAP 法操作煩瑣、影響結(jié)果的因素較多，而TP 法操作便捷、高效化，適用于多數(shù)基層單位，因此在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和需求靈活選擇。