HPLC-MS/MS 同位素內標法測定水產品中6 種喹諾酮藥物殘留量

常 波

（營口市農業農村綜合發展服務中心（營口市農產品質量安全檢驗監測中心），遼寧營口 115004）

水產養殖是一個不斷增長的全球性行業，隨著產量提高而不斷增加的獸藥使用量已成為全球關注的問題。其中喹諾酮類藥物是水產品殘留的主要獸藥之一，具有抗菌效果好、抗菌譜廣等特點，在水產養殖中被大量應用防治疾病[1]。如果長期食用喹諾酮類的食品可造成慢性中毒，引起細菌耐藥性等后果[2]。

從2015 年開始我國在動物源食品中禁止使用的喹諾酮類藥物有4 種，分別是諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星和培氟沙星4 種獸藥鹽類、酯類及其他制劑，國家標準《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[3]中魚（皮+肉）中恩諾沙星和環丙沙星之和殘留限量為100 μg·kg-1。雖然針對水產養殖用獸藥和非處方抗生素的使用有相應的控制和監管措施，但在養殖過程中仍會有過度使用導致藥物在動物食品中富集，通過生物鏈進入人體內，從而對人體健康造成危害[4]。

目前，喹諾酮類藥物常用檢測方法主要有液相色譜法和超高效液相色譜-串聯質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[5-7]，而液質聯用技術將超高效液相色譜和質譜的優點有效結合起來，具有專屬性高、靈敏度高，適用于復雜基質中痕量組分分析優勢，已成為當下獸藥殘留檢測的主要手段。農業部1077號公告-1-2008[8]是目前檢測水產品中喹諾酮類殘留的UPLC-MS/MS 方法，但實際操作中發現該方法基質效應大，因此本實驗在此方法基礎上用固相萃取柱C18進行凈化，有效改善基質效應的影響，保證結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚，購買于遼寧省營口市某農貿市場；諾氟沙星（純度98.8%）、環丙沙星（純度99.3%）、氧氟沙星（純度99.8%）、培氟沙星（純度99.8%）、洛美沙星（純度99.7%）、恩諾沙星（純度99.3%）、氘代諾氟沙星（諾氟沙星-D5，純度99.3%）、氘代恩諾沙星（恩諾沙星-D5，純度99.6%）和氘代環丙沙星（環丙沙星-D8，純度99.6%），均購自ANPEL；甲醇、乙腈（色譜純，德國Meker 公司）；乙酸、甲酸（色譜純，中國安譜有限公司）；C18固相萃取柱（500 mg，6 mL，Aglient）；試驗用水均為超純水。

Aglient 超高效液相色譜-質譜三重四極桿聯用儀6460（配有EI 離子源）；分析天平（感量0.01 g、0.000 01 g，瑞士Mettle Toledo 公司）；渦旋振蕩器（德國Heidolph）；1 000 μL 移液槍（德國艾本德）；冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific）；全自動氮吹濃縮儀N1（上海屹堯Preekem）；Milli-Q Advamtage 超純水器（美國Millipore）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取培氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、洛美沙星和恩諾沙星對照品10 mg（精確至±0.000 01 g），分別置于10 mL 棕色容量瓶中，先加甲酸200 μL 使其完全溶解，再用甲醇定容，混勻配制成濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液。精確移取喹諾酮標準儲備液適量，用甲醇稀釋配制成0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1的混合標準工作液。

準確稱取內標對照品諾氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、環丙沙星-D85.0 mg、10.0 mg、2.5 mg（精確至±0.000 01 g），分別置于10 mL、10 mL、5 mL棕色容量瓶中，先加甲酸200 μL 使其完全溶解，再用甲醇定容，混勻配制成0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1同位素內標標準儲備液。精密移取上述內標標準儲備液適量，用甲醇稀釋配成1.0 μg·mL-1的混合內標標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱取勻漿樣品5.0 g（準確至±0.02 g），置于50 mL塑料離心管中，準確加入50 μL 諾氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、環丙沙星-D8混合內標標準工作液，渦旋混勻30 s，避光放置10 min，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混合1 min，超聲提取5 min，10 000 r·min-1，離心5 min，上清液轉移到另一個50 mL 離心管中，向殘渣中加入10 mL 1%乙酸乙腈重復提取1 次，合并兩次提取液，于40 水浴中氮吹至近干，用5 mL 10%甲醇水溶解殘渣，渦旋混勻備用。用6 mL 甲醇和6 mL 水依次活化凈化柱C18，取5 mL 備用液上樣，加水6 mL 淋洗，每次3 mL，棄去流出液，用6 mL 甲醇洗脫，將洗脫液在40 水浴中氮吹至近干，1 mL流動相定容；過0.22 μm有機微孔濾膜至進樣瓶，LC-MS/MS 待測定。

1.2.3 標準曲線制備

采用空白樣品所得溶液稀釋標準溶液制得空白基質標準曲線。取空白樣品按照“1.2.2”的方法處理，在經提取凈化氮吹后的殘余物中加入流動相制得空白基質，添加適量混合標準工作液制得濃度分別為0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1和0.20 μg·mL-1系列標準工作液，其中內標濃度為0.05 μg·mL-1，供超高效液相色譜-串聯質譜法測定。以測得定量離子峰面積和內標峰面積比為縱坐標、質量濃度為橫坐標，制得標準曲線回歸方程和相關系數。

1.2.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ，進樣量：5.0 μL，流速：0.3 mL·min-1。流動相：0.1%甲酸水-甲醇（0.1%甲酸），梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

（2）質譜MS 條件。負離子電噴霧ESI-多反應監測模式，掃描方式：負離子；毛細管電壓：4 000 V；霧化氣壓力：40 psi；氣流溫度：325 ；鞘氣流速：10 L·min-1。

1.2.5 樣品的回收率和精密度

取空白魚肉樣品中添加5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、50.0 μg·kg-1混合標準工作液，按“1.2.2”方法處理，進行加標回收實驗，每個樣品制備3 個平行樣。

2 結果與分析

2.1 樣品提取劑優化

本方法研究了水產品前處理中加入甲醇、乙腈、乙腈（1%甲酸）、乙腈（1%乙酸）對喹諾酮類藥物的提取率的影響，其中乙腈（1%乙酸）的提取效果要大于乙腈（1%甲酸），這6 種喹諾酮對乙腈（1%乙酸）更敏感，切斷化合物與蛋白質的結合，更容易溶于乙腈（1%乙酸），提取率會更高。因此，本實驗方法采用乙腈（1%乙酸）作為提取劑。而單獨的甲醇和乙腈提取率不佳，可能由于魚肉基質復雜，導致喹諾酮與雜質復合沉淀，影響提取效果。

2.2 工作曲線線性范圍

為了減少基質干擾，本實驗采用空白基質配制標準曲線。結果表明，在0.01 ～0.20 μg·mL-1線性相關系數均大于0.99，線性關系良好，滿足測定要求。線性回歸方程及相關系數見表2。

表2 標準曲線的回歸方程及相關系數

2.3 方法的回收率和精密度

在5.0 g 空白鯉魚肉中添加低、中、高3 個濃度水平標準溶液，添加濃度分別為0.1 μg·mL-1喹諾酮混合標準溶液250 μL，1 μg·mL-1喹諾酮混合標準溶液50 μL，1 μg·mL-1喹諾酮混合標準溶液250 μL，添加濃度水平分別為5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、50.0 μg·kg-1，添加的混合物內標濃度為0.05 μg·mL-1，每個添加水平做6 個平行，按照1.2.2 前處理的方法進行處理，測定喹諾酮峰響應值的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）（%），計算方法的回收率和精密度。結果顯示，3 個添加水平的平均回收率為89%～102%，精密度為3.9%～5.2%（表3），滿足測定要求。

表3 方法回收率和精密度RSD 結果表（n=6）

3 結論

本方法建立了同時測定鯉魚中6 種喹諾酮類獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。試樣經酸化乙腈提取，固相萃取柱C18凈化，能有效去除基質中大部分雜質，UPLC-MS/MS 分析檢測。采用同位素內標法和空白基質匹配標準對檢測結果進行校正，能有效改善基質效應的影響，保證檢測結果的準確性。