用于乙型肝炎病毒相關(guān)研究的人源化嵌合肝臟小鼠模型應(yīng)用進展

沈磊，張思航，周太成，韋嘉

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院感染科，昆明 650000；2 云南大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室；3 云南大學(xué)附屬醫(yī)院感染科

盡管已有多種抗HBV 療法應(yīng)用于臨床，但HBV感染仍是全球主要的公共衛(wèi)生問題［1-2］。由于HBV的宿主范圍狹窄，導(dǎo)致建立理想的HBV 感染動物模型成為難題。近年來，人源化小鼠模型引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注［3-4］。人源化小鼠模型是一類攜帶人的功能基因、細胞、組織或器官的小鼠模型；人源化嵌合肝臟小鼠模型是具有肝損傷及免疫缺陷特點的小鼠模型，常通過手術(shù)、藥物或基因編輯來破壞小鼠肝細胞，再將人肝細胞在小鼠脾內(nèi)注射，移植的人肝細胞通過小鼠脾靜脈和門靜脈遷移到肝臟，并開始增殖以取代損傷的小鼠肝細胞，進而形成嵌合肝臟小鼠［5］。與HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠模型、高壓水動力注射小鼠模型及病毒載體介導(dǎo)小鼠模型相比，人源化嵌合肝臟小鼠模型可被HBV 成功感染，且支持完整的HBV 生命周期，可產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄活性的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA（cccDNA）［6-7］，是當(dāng)前HBV 研究及新藥研發(fā)的重要工具［8］。現(xiàn)就HBV研究相關(guān)的人源化嵌合肝臟小鼠模型應(yīng)用進展綜述如下，為相關(guān)研究中HBV易感動物模型的選擇提供參考。

1 基于Alb-uPA小鼠的嵌合肝臟模型

Alb-uPA 轉(zhuǎn)基因小鼠是HECKEL 等于1990年研發(fā)，主要用于新生兒出血性疾病的研究［9］。該模型中，小鼠攜帶尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA），并由白蛋白（Alb）啟動子控制。該模型通過上調(diào)小鼠體內(nèi)uPA 表達，導(dǎo)致小鼠形成嚴(yán)重的低纖維蛋白原血癥和肝細胞損傷。Alb-uPA 小鼠模型的肝損傷狀態(tài)為外源性肝細胞的植入創(chuàng)造了條件。在此背景下，研究人員將uPA轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷鼠如無胸腺（nu/nu）裸 鼠、重 組 體 激 活 基 因2（Rag2）敲 除（Rag2-/-）小鼠或重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠進行雜交，得到Alb-uPA/Rag2-/-或Alb-uPA/SCID 等免疫缺陷型肝損傷小鼠模型［10-11］。

該模型可被HBV 成功感染，且模型的構(gòu)建無外源性藥物干預(yù)，可適用于臨床抗HBV 相關(guān)藥物研究。KLUMPP 等［12］發(fā)現(xiàn)，在Alb-uPA/SCID 小鼠中，衣殼組裝調(diào)節(jié)劑NVR3-778 比恩替卡韋具有更高的抗病毒活性，可同時降低血清HBV DNA、HBV RNA水平。研究人員還利用該小鼠模型證明了HBV 感染不能誘導(dǎo)肝細胞干擾素應(yīng)答［13］。然而，該模型易導(dǎo)致新生小鼠出血及腎臟疾病，且小鼠繁殖效率低、移植時間窗窄，阻礙了Alb-uPA小鼠模型的應(yīng)用［14］。

2 Alb-rtTA/TRE-uPA嵌合肝臟小鼠模型

為優(yōu)化Alb-uPA 小鼠模型，SONG 等［15］將TREuPA 轉(zhuǎn)基因小鼠與Alb-rtTA 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，構(gòu)建出Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠。在四環(huán)素強力霉素作用下，反義四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子（rtTA）與四環(huán)素應(yīng)答元件（TRE）結(jié)合并激活靶基因轉(zhuǎn)錄，uPA 在小鼠肝細胞中表達并引起廣泛肝損傷。在此基礎(chǔ)上，將Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠連續(xù)8 代回交到NRG（NOD背景的Rag2nullIl2rgnull小鼠）背景，獲得Alb-rtTA/TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠，簡稱URG 小 鼠。在此模型中，可以通過調(diào)節(jié)Ad. TRE-uPA 及四環(huán)素強力霉素的劑量來控制肝損傷程度，實現(xiàn)肝損傷可控，以利于后續(xù)的人肝細胞體內(nèi)植入和增殖。

與原uPA 小鼠相比，URG 小鼠需要長期使用外源性藥物四環(huán)素強力霉素誘導(dǎo)肝損傷，但該模型實現(xiàn)了uPA 僅在肝內(nèi)可控性表達，成功解決了傳統(tǒng)Alb-uPA 嵌合小鼠模型的缺陷問題，使其繁殖效率顯著提高，潛在出血情況減少，移植時間窗更加靈活，從而使該模型的應(yīng)用范圍更加廣泛。LI 等［16］通過URG 小鼠模型驗證了肝細胞樣細胞的功能有效性，使肝功能衰竭的恢復(fù)成為可能。YANG 等［17］使用該小鼠模型發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶1的表達與HBV 復(fù)制呈正相關(guān)，并證實組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶1信號通路參與HBVcccDNA 小染色體的組裝和表觀遺傳調(diào)控。

3 FRG嵌合小鼠模型

2007 年，AZUMA 等［18］通過將延胡索乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除小鼠（FAH-/-）與RAG2-/IL2RG-/-雙重免疫缺陷小鼠雜交，首次構(gòu)建出FAH-/-RAG2-/IL2RG-/-（FRG）小鼠。白細胞介素2（IL-2）受體γ鏈（IL-2Rγ）與淋巴細胞增殖活化及NK細胞的發(fā)育密切相關(guān)，將其敲除可使小鼠T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的發(fā)育和功能嚴(yán)重受損，并完全阻斷NK 細胞的發(fā)育。富馬酰乙酰乙酸酯水解酶（FAH）是酪氨酸代謝過程中所必需的酶，其缺失會導(dǎo)致富馬酰乙酰乙酸酯在肝細胞中積累，后者對肝細胞具有毒性作用，進而導(dǎo)致肝細胞損傷［19］。為防止FRG 小鼠肝細胞中富馬酰乙酰乙酸酯過度積累，可通過口服2-（2-硝酸-4-三氟甲基苯甲酰）-1，3-環(huán)己基二酮（NTBC）來阻斷FAH 上游的羥苯基丙酮酸雙加氧酶活性，從而起到減輕肝損傷的作用［20］。

FRG 嵌合小鼠模型可以通過給予或停用NTBC來控制小鼠肝損傷程度，可以在任何鼠齡植入人肝細胞，并且可以連續(xù)多次植入［21］，人肝細胞嵌合率高達95%［20］。然而，F(xiàn)ah 小鼠也會因Ⅰ型酪氨酸血癥而發(fā)展為肝癌，并且需要在人源化后繼續(xù)或間歇性地進行藥物治療以抑制肝癌的發(fā)展［22］。

4 TK-NOG嵌合小鼠模型

為了克服uPA/SCID 和FRG 小鼠的缺陷，日本學(xué)者將NOD/scid 小鼠和γ 鏈IL-2 受體敲除鼠進行雜交，構(gòu)建出免疫缺陷NOD/Shi-scid（NOG）小鼠［23］。將單純皰疹病毒1 型胸苷激酶（HSVtk）表達片段顯微注射到NOD/Shi 品系小鼠受精卵中，構(gòu)建HSVtk轉(zhuǎn)基因小鼠，再將雌性轉(zhuǎn)基因小鼠與雄性NOG 小鼠交配，從而產(chǎn)生TK-NOG 小鼠。HSVtk 轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包含小鼠白蛋白增強子/啟動子，HSVtk mRNA 在TK-NOG小鼠肝臟中選擇性表達，使TK-NOG小鼠發(fā)生特異性肝損傷［24］。

在TK-NOG 小鼠模型中，表達HSVtk 的小鼠肝細胞暴露于更昔洛韋后發(fā)生凋亡，使得移植的人肝細胞在小鼠肝臟中穩(wěn)定維持。該小鼠模型造模成功后，后續(xù)無需外源性藥物維持，且增加更昔洛韋劑量可提高人肝細胞移植率。該小鼠模型成功感染HBV 后，可至少連續(xù)20周觀察到肝組織中HBs抗原呈陽性［25］。此外，與uPA/SCID 和FRG 小鼠模型相比，TK-NOG 小鼠模型的主要優(yōu)勢是不易出現(xiàn)腎病、肝臟腫瘤等疾病，其主要缺點是雄性小鼠不育［26］。

5 人源化雙嵌合小鼠模型

5.1 AFC8-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型 雖然上述人鼠嵌合肝臟模型成功克服宿主物種限制和疾病建模方面的障礙，但小鼠缺乏免疫系統(tǒng)，使其無法用于研究宿主免疫反應(yīng)和肝炎病毒誘導(dǎo)的免疫病理。2011年，WASHBURN等及ROBINET等［27-28］研發(fā)出一種具有人免疫系統(tǒng)和人肝細胞的人源化雙嵌合小鼠模型，即AFC8-hu HSC/Hep 小鼠模型。研究人員將FK506結(jié)合蛋白（FKBP）-Caspase-8結(jié)合蛋白（AFC8）基因轉(zhuǎn)入Balb/C Rag2-γ C-null 小鼠受精卵中，構(gòu)建出AFC8轉(zhuǎn)基因小鼠。FKBP與白蛋白啟動子激活的Caspase-8結(jié)合，在AP20187的誘導(dǎo)下，可使小鼠肝細胞發(fā)生特異性凋亡。在此基礎(chǔ)上，將人原代肝細胞（Hep）和CD34+造血干細胞（HSC）移植到AFC8 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，即構(gòu)成AFC8-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型［29-30］。

此模型可同時具備人免疫系統(tǒng)及人肝細胞，在HBV 免疫機制研究及疫苗研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。然而該模型不僅造模困難、費用昂貴，而且人肝細胞嵌合率較低，遠不及Alb-uPA/SCID、FRG 等人源化小鼠模型的人源化肝臟重建率，使得該模型無法廣泛應(yīng)用于HBV相關(guān)研究［31］。

5.2 A2/NSG-hu HSC/Hep雙嵌合小鼠模型 BILITY等［32］將人原代肝細胞和CD34+造血干細胞直接注入HLA-A2轉(zhuǎn)基因的NOD/SCID/IL2rγnull（NSG）新生小鼠（A2/NSG）肝臟，實現(xiàn)人肝細胞及免疫系統(tǒng)雙嵌合。A2/NSG小鼠攜帶人類HLA-A2基因，可促進主要組織相容性復(fù)合體限制T細胞的發(fā)育［33］。在該模型中使用小鼠特異性抗Fas激動劑抗體可使小鼠肝細胞發(fā)生特異性凋亡，從而使移植的人肝細胞具有再生優(yōu)勢［34］。

與其他人源化嵌合肝臟小鼠相比，A2/NSG-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型不僅具有人肝細胞和免疫系統(tǒng)，還支持HBV持續(xù)性感染、抗HBV免疫反應(yīng)，且可在HBV 感染的嵌合肝組織中觀察到活化的人M2 樣巨噬細胞積累。該模型最顯著的缺點為人肝細胞來自胎兒肝祖細胞，且移植水平相對較低（20%），導(dǎo)致該小鼠模型血液HBV 滴度較低，同時也存在動物倫理的限制［35］。

總之，發(fā)展有前景的HBV 易感動物模型是研究HBV 感染機制、開發(fā)HBV 感染新療法的關(guān)鍵。由于HBV 及動物模型的自身生理特性，高壓水動力注射模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型及病毒載體介導(dǎo)小鼠模型等均無法在小鼠體內(nèi)形成HBVcccDNA，使其難以為后續(xù)研究提供強有力的科學(xué)支撐。相比之下，人肝嵌合小鼠不僅對HBV 感染敏感，而且能夠在小鼠體內(nèi)形成HBVcccDNA，是當(dāng)前模擬臨床HBV感染患者的最佳模型，被廣泛應(yīng)用于肝損傷、基因調(diào)節(jié)、藥物毒性和嗜肝病毒感染等相關(guān)研究中，并為抗HBV 藥物的研發(fā)與評估提供了實驗基礎(chǔ)。目前為止，已有多種人源化嵌合小鼠模型被研發(fā)出來，具有各種優(yōu)點和局限性。人源化嵌合肝臟小鼠模型主要面臨著價格昂貴、制備過程復(fù)雜、技術(shù)要求苛刻、無法遺傳等共性問題。隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，相信以上種種限制會被逐一攻克，且在已有技術(shù)條件基礎(chǔ)上，最終服務(wù)于臨床，為HBV患者提供更加精準(zhǔn)的個性化治療。