血清外泌體microRNAs單一及組合panel對結直腸癌的診斷價值

郝劍 韓磊

河北北方學院附屬第一醫院1檢驗科，2胃腸外科（河北張家口075000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國第三常見的惡性腫瘤［1］。早期CRC 患者經有效治療后5年生存率可以超過90%，但約1/4 的患者在初診時已發生局部或遠處轉移，其5年生存率僅為約12%［2］。早發現、早診斷、早治療是目前公認的能夠有效提高CRC 治療療效的策略，目前臨床常用的實驗室診斷檢測主要有糞便潛血檢測和血液標志物檢測，但二者敏感性和特異性不足［3］；影像學檢查可以有效評估病變范圍和腫瘤分期，但對早期病變的診斷價值有限［4］；內鏡聯合組織活檢是目前早期診斷CRC 的金標準，但存在操作繁瑣、患者依從性差、侵入性強等缺點［5］。因此，臨床實踐中迫切需要一種微創或無創、靈敏且準確的早期診斷方法。液體活檢技術因其無創、全面、實時、可重復監測等特點而備受推崇。外泌體miRNA 是目前液體活檢的主要項目之一，其在腫瘤的早期診斷、療效評估和預后評估方面具有潛在的臨床應用價值［6］。一項研究發現，原發性早期CRC 患者血清中多個miRNAs 的含量明顯高于健康組，提示其可作為潛在的CRC 早期診斷標志物［7］。既往研究報道miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 與CRC 的惡性生物學行為密切相關［8-11］，但關于4 種miRNA 的表達水平及其對CRC 患者的診斷價值的研究相對較少。因此，本項研究旨在評估上述4 種外泌體miRNA 在CRC 患者外周血中的表達情況，并評估其對CRC 的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年3月至2022年5月本院收治的123 例結直腸癌患者（結直腸癌組）及117 例結直腸腺瘤患者（結直腸腺瘤組）作為研究對象，并納入150例健康對照者作為對照（健康對照組）。受試者入組后收集其年齡、性別、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小等相關信息。結直腸癌組納入標準包括：（1）手術病理確診；（2）未接受放療、化療或其他腫瘤相關治療。排除標準包括：肝、腎和其他器官功能障礙的患者。結直腸腺瘤（colorectal adenoma，CA）患者納入標準包括：通過腸鏡病理學確診。排除標準包括：無腫瘤病史，無其他腸道疾病，無肝、腎或其他器官功能障礙。健康對照組納入標準：腸鏡檢查腸道內未發現異常。排除標準包括：腫瘤病史和心臟、肝臟、腎臟或其他器官功能障礙。本研究經患者之情同意并經本院倫理委員會批準，倫理批號：HBBFYXY202203024。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑ABI7900 實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo-Fisher 公司，GH8935K Nano sight 納米粒度儀購自英國Nano-sight 公司，外泌體提取試劑盒Exo-Quick-TM（貨號：ND25792-6）、SYBR Premix ExTaq 試劑盒（貨號：N5643MJ）購自美國CST 公司，Prime-Script RT reagent 試劑盒（貨號：ND6527J）購自購自北京百奧生物科技公司，CD9 抗體（貨號：75882）、CD63 抗體（貨號：45368）、Calnexin 抗體（貨號：6387941）均購自美國CST公司。

1.2.2 血清外泌體提取與鑒定收集受試者5 mL外周靜脈血置于不含抗凝劑的試管中，室溫下3 000g離心15 min，根據ExoQuickTM試劑盒說明書進行后續操作，渦旋后的血清和外泌體試劑混合物在4 ℃下沉淀30 min，1 500g離心30 min，棄上清液，再次1 500g離心5 min 得到沉淀，重懸于200 μL 磷酸鹽緩沖液中，使用0.22 μm 無菌過濾器過濾，制備所需大小和濃度的外泌體。利用納米粒子追蹤分析技術和蛋白質印跡檢測外泌體標記蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin 的表達，對血清外泌體進行鑒定。

1.2.3 qRT-PCR 檢測血清外泌體miRNA采用TRizol 法從血清外泌體中提取總RNA。Nano Drop用于檢測RNA 的濃度。逆轉錄體系包括：總RNA 12 μL、2.5 U/μL PolyA 聚合酶1 μL、Mix 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL 和ddH2O 6 μL。以U6 為內參，檢測miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 的相對表達量。反應條件為：95 ℃10 min；然后是95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，共40 個循環。2-ΔΔCt方法用于計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統計學方法通過SPSS 22.0 統計軟件對數據進行分析。符合整正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用受試者工作特征曲線（ROC）預測診斷價值，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征本研究新診斷結直腸癌患者123例，其中男59 例，女64 例，年齡（51.60 ± 11.41）歲，見表2。同期共入組117 例經視頻結腸鏡檢查確診為結直腸腺瘤的患者，其中男59 例，女58 例，年齡（51.55 ± 10.17）歲。納入我院健康對照者150 例為健康對照組，其中男76 例，女74 例，年齡（52.30 ±11.25）歲。

表2 結直腸癌患者臨床病理特征Tab.2 Clinicopathological features of patients with colorectal cancer 例

2.2 各組中miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 相對表達水平與健康對照組相比，結直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-16 及miR-31 表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與結直腸腺瘤組比較，結直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-31 差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對表達量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對表達量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與結直腸腺瘤組比較，#P ＜0.05

組別結直腸癌組（n= 123）腸腺瘤組（n= 117）健康對照組（n= 150）F 值P 值miR-15b 11.94± 3.81*#2.45± 0.02 1.21± 0.08 40.16 0.009 miR-16 2.83± 0.33*1.27± 0.12 0.79± 0.33 36.54 0.015 miR-21 8.59± 1.61*#2.14± 0.22 1.27± 0.07 18.36＜0.001 miR-31 7.16± 1.17*#1.68± 0.37 1.22± 0.15 39.12＜0.001

2.3 miR-15b、miR-21、miR-31 水平與結直腸癌患者臨床病理相關性Ⅲ～Ⅳ期結直腸癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統計學意義（P= 0.778），見表4。結直腸癌伴淋巴結浸潤患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31水平高于結直腸癌不伴淋巴結浸潤患者，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統計學意義（P= 0.06），見表5。結直腸癌低分化腺癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于結直腸癌中-高分化患者，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統計學意義（P=0.12），見表6。

表4 不同分期結直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

表4 不同分期結直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

組別Ⅲ-Ⅳ期（n=78）Ⅰ-Ⅱ期（n=45）t值P值miR-15b 14.54±0.68 9.04±0.72 12.31 0.006 miR-16 2.26±0.08 1.90±0.12 18.35 0.778 miR-21 10.78±0.09 7.94±0.44 22.11 0.026 miR-31 7.56±0.87 6.16±1.22 13.54＜0.001

表5 結直腸癌伴或不伴淋巴結浸潤患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

表5 結直腸癌伴或不伴淋巴結浸潤患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

組別淋巴結浸潤（n = 83）無淋巴結浸潤（n = 44）t 值P 值miR-15b 13.69 ± 1.22 7.28 ± 1.32 22.78＜0.001 miR-16 3.06 ± 0.15 2.99 ± 0.22 19.35 0.06 miR-21 11.01 ± 0.02 8.22 ± 0.29 10.25＜0.001 miR-31 8.18 ± 0.37 5.98 ± 1.32 8.91＜0.001

表6 結直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

表6 結直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

組別中-高分化腺癌（n = 49）低分化腺癌（n = 78）t 值P 值miR-15b 14.09 ± 0.88 6.12 ± 2.19 12.18＜0.001 miR-16 2.66 ± 1.18 2.12 ± 1.56 6.22 0.12 miR-21 10.89 ± 0.17 7.99 ± 0.83 19.51＜0.001 miR-31 9.01 ± 0.13 6.10 ± 1.66 18.22 0.029

2.4 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 對結直腸癌患者的診斷價值采用ROC 曲線評估miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 在結直腸癌中的診斷價值。miR-15b 的AUC 為0.86（0.82～0.91），miR-16、miR-21、miR-31 的AUC 分別為0.58（0.51～0.65）、0.75（0.69～0.81）、0.75（0.68～0.82），4 種miRNA 中評價效力最高的指標是miR-15b，敏感度和特異度分別為81.33%和91.80%，（P＜0.05）；評價效力最差指標為miR-16，敏感度和特異度分別為42.68%和52.33%（P＜0.05）。進一步采用logistic 分析對miR-15b、miR-21和miR-31組合panel診斷價值進行評估，結果顯示三者組合panel 具有更好的敏感度和特異度：91.95%和97.62%（P＜0.01）。見圖1。

圖1 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 及組合panel 對結直腸癌患者的診斷價值Fig.1 Diagnostic value of miR-15b，miR-16，miR-21，miR-31 and combined panel in patients with colorectal cancer

3 討論

在我國CRC 發病率和病死率一直居高不下，且由于早期診斷方法缺乏敏感性和特異性，其總體趨勢依然呈上升趨勢［12］。miRNA 是由19～24 個核苷酸組成的小型非編碼RNA 分子，其通過與靶基因mRNA 的3′端非翻譯區結合來觸發mRNA 的降解，從而抑制蛋白質翻譯以調節基因表達，miRNAs的異常表達與許多腫瘤等疾病密切相關，已證實miRNAs 具有致癌或抑癌活性［13］。外泌體miRNA作為腫瘤基質與腫瘤細胞之間信號交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發生和轉移的所有生物學過程［14］。與傳統的腫瘤標志物相比，外泌體來源的miRNA 具有較高的敏感性和特異性，檢測腫瘤來源外泌體中miRNA 的類型和含量，對腫瘤臨床診斷和治療具有重要意義。一項研究分析了746 例CRC 患者和476 例健康受試者，結果顯示miR-21 診斷CRC 的敏感度和特異度分別為72%和85%，證實其具有作為CRC 診斷標志物的良好潛力［15］。

本研究結果顯示，miR-15b 是CRC 診斷的潛在生物標志物，且miR-15b、miR-21 和miR-31 組合panel 具有更好的診斷價值，這與之前的研究結果相符。miR-15b 屬于miR-15 家族，其位于3q25.33 染色體區域。研究表明，miR-15b 在許多腫瘤中異常表達，例如miR-15b 在舌癌、宮頸癌和胰腺癌細胞中上調，并充當癌基因［16］。miR-15b 的異常表達可用于各種腫瘤的診斷，也可作為復發檢測的重要生物標志物。一項研究表明，miR-15b在肝癌復發患者中的表達顯著增加，miR-15b 可能與MTSS1 結合以調節細胞周期，而MTSS1 是一種多功能蛋白，在腫瘤發生和發展中起重要作用，MTSS1 的下調可作為肺鱗狀細胞癌早期輔助治療階段進展的標志物［17］。miR-15b 通過靶向下調MTSS1 表達促進CRC 細胞增殖，抑制miR-15b 可上調MTSS1 表達，從而抑制癌細胞增殖［18］。一項薈萃分析發現，血液中的miR-21 水平可用于檢測CRC，其具有良好的敏感性和特異性：血液miR-21的診斷效率高于糞便miR-21，血清標本中miR-21的檢測優于血漿標本［19］。許多研究表明，miR-31作為一種致癌物質，可以調節腫瘤的生長、凋亡、轉移和化療耐藥，miR-31 的表達增加與CRC 腫瘤的進展有關，提示血清miR-31 可用于CRC 的診斷［20］。此外miRNA panel 作為不同miRNA 的組合，可以提高其檢測效率。一項包括1 558 例CRC患者和1 085 例健康受試者的薈萃分析結果顯示，循環外泌體的miR-1246 和miR-23a 組合panel 診斷CRC 的敏感度和特異度分別高達95%和92%［21］。

總之，本研究評估了4 種血清外泌體miRNA：miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 的臨床價值，并且我們發現4 種miRNA 在結直腸癌患者外周血中異常表達，且其中的miR-15b、miR-21 和miR-31 表達水平與臨床TNM 分期、淋巴結浸潤呈正相關，與分化程度呈負相關；此外相較于單一miRNAs 檢測，miR-15b、miR-21 和miR-31 的組合panel 可以更好地區分健康對照組和結腸癌患者，其敏感度和特異度分別為95.06%和94.44%，這對于提高結直腸癌臨床診斷效率具有潛在的參考價值。但本研究仍然存在局限性，相對較小的單中心樣本量限制了該研究的應用價值，后續將進一步進行完善。

【Author contributions】HAN Lei designed the study,HAO Jian conducted experiments and wrote the manuscript,and HAN Lei revised the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.