肉桂醛對PC-3細胞增殖、EMT及干細胞特性的影響

吳俊檄 唐欲博 令狐熙濤 包廣龍 施浩然 文振宇 黃帥 瓦慶德

1遵義醫科大學第二附屬醫院骨外科（貴州遵義563000）；2中山大學附屬第一醫院藥學部（廣州510260）；3廣州醫科大學附屬第二醫院骨外科（廣州510260）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）骨轉移發生率高，且呈逐年上升趨勢，對于PCa 骨轉移患者，其生存質量差且總體生存率欠佳［1-2］。隨著PCa 骨轉移機制探索的不斷深入，許多骨靶向藥物及新型治療藥物被陸續應用于臨床，盡管其治療取得了部分進展，但其效果仍有待進一步提高［3-4］。因此，探索抑制PCa 骨轉移的新型治療藥物具有重要的意義。目前研究發現肉桂醛（CA）是一種存在于肉桂和月桂葉中的天然化合物，具有較好的抗瘤活性，其可通過調控微小RNAs（microRNAs，miRNAs）及相關信號通路影響腫瘤的發生發展［5-9］。近來研究發現，CA 對PCa 細胞具有明顯的細胞毒性，其可通過自噬依賴性細胞凋亡的方式誘導PCa 細胞死亡［6］。然而，CA 能否通過調控miRNA 的表達影響PCa 骨轉移目前尚未明確。既往研究發現，miR-143 是PCa 骨轉移的重要調控因子，在PCa 骨轉移性腫瘤中的miR-143 表達水平明顯低于原發性腫瘤，miR-143 可通過調控PCa 骨轉移瘤細胞（PC-3細胞）的EMT及干細胞特性抑制PCa 骨轉移［10-11］。因此本研究以PC-3細胞為研究對象，擬進一步探索CA 能否通過調控miR-143 表達影響PC-3細胞的增殖、EMT及干細胞特性，為CA 作為潛在的抗PCa 骨轉移藥物提供前期實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料PC-3細胞（人前列腺癌骨轉移瘤來源細胞株）（ATCC 公司），純度≥95%的肉桂醛溶液（美國Sigma 公司），AGO2、ZEB1、N-cadherin、fibronectin、vimentin、CD44、Oct-4、c-Myc 及α-tubuin 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司），CCK-8試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），逆轉錄試劑盒、RNA 抽提試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司），超敏ECL 化學發光試劑盒及BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞形態觀察調整PC-3細胞懸液的密度為1 × 104個/孔，接種至24 孔板中，然后分別加0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液共培養24 h，鏡下觀察PC-3細胞的形態變化。

1.2.2 CCK-8 試驗調整PC-3細胞懸液濃度后接種至96 孔培養板中（密度為4 × 103個/孔），細胞貼壁后加入0、5、10、15、30、60 μmol/L 的CA 溶液，每組設5 個復孔，培養24 h 后在每個孔中加入CCK-8試劑液10 μL，孵育2 h 后檢測各孔的吸光度值。

1.2.3 Transwell 試驗將密度為1 × 106個/mL 的PC-3細胞懸液100 μL 接種于Transwell 上室，0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液加入下室然后繼續培養24 h。取出Transwell 小室，固定、洗滌，小心去除上室面的PC-3細胞，然后染色，晾干，倒置顯微鏡下觀察細胞特點，拍照并計算數量，算出平均值。在檢測細胞的遷移能力時，不需要在上室中添加Matrigel 基質膠，而在檢測細胞侵襲能力時，需要將Matrigel 基質膠稀釋液（1∶5）包被在Transwell上室中，其余條件同遷移試驗。

1.2.4 黏附試驗取部分PC-3細胞懸液（1×106個/孔）接種到6孔板中，然后加入0、5、10、20 μmol/L 的CA 溶液處理24 h，重懸每組細胞至1 × 104個/孔后接種在FN 包被的96 孔板中，培養2 h 后，封閉，洗滌，固定，染色，然后在顯微鏡下觀察，拍照計數。

1.2.5 成球試驗0、5、10、20 μmol/L 的CA 與PC-3細胞共同孵育24 h。0.25%胰酶消化PC-3細胞后用無血清RPMI1640 培養基制作細胞懸液至1 ×106個/mL，接種于24 孔培養板中繼續培養14 d，計數球體數量，觀察拍照。

1.2.6 qRT-PCR 分析0、5、10、20 μmol/L 的CA溶液分別與PC-3細胞共同培養24 h，低溫環境下抽提總RNA，然后將總RNA 樣本立即逆轉錄成cDNA。使用實時PCR 試劑盒進行PCR 擴增共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算miR-143、AGO2 mRNA的相對表達水平。相關引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers used for qRT-PCR

1.2.7 細胞轉染0.25%胰酶消化PC-3細胞后制成細胞懸液，接種至6 孔平板中（1 × 106個/孔），在37 ℃、5% CO2培養箱中培養細胞密度至40%，使用Lipofectamine 3000 轉染試劑將miR-143mimic、AGO2-siRNA 或AGO2 mRNA 轉染入PC-3細胞。

1.2.8 Western blot 分析分別用10 μmol/L 的CA溶液、miR-143mimic、Vetor 轉染PC-3細胞，接種四組PC-3細胞24 h 后，混合裂解液提取總蛋白并進行BCA 標準法定量。在10%～12%的SDS-PAGE凝膠中進行電泳，電轉，2 h 后封閉，1 h 后加入一抗稀釋液AGO2、ZEB1、N-cadherin、fibronectin、vimentin、CD44、Oct-4、c-Myc 和α-tubuin，避光低溫孵育。然后加入二抗低速震蕩1 h，洗滌3 次，選用ECL 發光檢測，曝光成像。

1.3 統計學方法用SPSS 18.0 及GraphPad Prism進行統計分析和作圖，用均數±標準差表示資料的數據。通過t檢驗、單因素方差分析方法對數據進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CA 對PC-3細胞增殖、遷移、侵襲、黏附及成球的影響CCK-8 實驗結果顯示，CA 呈濃度依賴性抑制PC-3細胞的增殖（P＜0.01，圖1B），其IC50值約為19 μmol/L，選用0、5、10、20 μmol/L 濃度梯度的CA 溶液用于后續實驗。鏡下觀察發現隨著CA 濃度不斷增加PC-3細胞的形態從規則梭形逐漸變成圓形并出現細胞碎片（圖1C）。Transwell 實驗結果顯示CA 可抑制PC-3細胞的體外遷移及侵襲能力，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01，圖1D-E）。黏附實驗結果顯示CA 可降低PC-3細胞的黏附能力（P＜0.01，圖1F）。成球實驗發現，加入CA 后PC-3細胞的成球能力顯著低于對照組（P＜0.01，圖1G）。

圖1 CA 抑制PC-3細胞的增殖、遷移、侵襲、黏附及成球能力（× 100）Fig.1 CA inhibited proliferation，migration，invasion，adhesion and spheres formation of PC-3 cell in vitro（× 100）

2.2 過表達AGO2 可逆轉CA 及miR-143 對PC-3細胞侵襲、遷移和黏附的影響

2.2.1 CA對PC-3細胞中miR-143及AGO2 mRNA表達的影響qRT-PCR 實驗結果顯示，與對照組相比，CA可顯著上調miR-143的表達（P＜0.01，圖2A）；同時，CA 可呈濃度依賴性下調PC-3細胞中AGO2 mRNA 的表達，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01，圖2B）。

圖2 CA 上調PC-3細胞中miR-143 表達，抑制AGO2 mRNA 的表達Fig.2 CA upregulate the expression of miR-143 and downregulate the expression of AGO2 mRNA in PC-3 cells

2.2.2 CA、AGO2 及miR-143 對PC-3細胞遷移、侵襲和黏附的影響Transwell 及基質黏附實驗結果提示，與對照組比，CA、過表達miR-143 及沉默AGO2 均能抑制PC-3細胞的遷移、侵襲及黏附（P＜0.01），而同時加入CA 及上調AGO2、同時上調miR-143 及AGO2 后PC-3細胞遷移、侵襲及黏附的抑制作用較對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 AGO2 可逆轉CA 或過表達miR-143 對PC-3細胞侵襲、遷移和黏附的抑制作用Fig.3 AGO2 rescued the effects of overexpressed miR-143 or CA on migration，invasion and adhesion of PC-3 cells in vitro

2.3 CA 及miR-143 對PC-3細胞EMT及干細胞特性的影響Western blot 實驗發現加入CA 或上調miR-143 后PC-3細胞中AGO2 及EMT 相關蛋白波形蛋白、N-鈣黏蛋白、纖連蛋白及ZEB1 的表達明顯下降（P＜0.05，圖4A）；此外，CA 或上調miR-143后PC-3細胞的干細胞特性相關蛋白CD44、Oct-4及c-Myc 蛋白的表達均明顯下降，與對照組比差異均有統計學意義（P＜0.05，圖4B）。

圖4 CA 或過表達miR-143 抑制PC-3細胞中AGO2、EMT及干細胞特性相關蛋白表達Fig.4 CA or overexpression of miR-143 inhibits the expression of AGO2，EMT and stem cell property related proteins of PC-3 cells in vitro

3 討論

PCa 骨轉移的治療方式包括非骨特異性抗癌藥物治療、分子靶向藥物治療及放射性藥物治療等，雖提高了部分患者總體生存率，但總體療效仍欠佳［12-13］。隨著CA 抗腫瘤作用的不斷深入研究，MEI 等［14］提出CA 可通過調控TLR4 依賴的信號通路影響PCa 相關成纖維細胞的功能，進而抑制PCa的進展。此外，CA 還可通過抑制腫瘤相關成纖維細胞的線粒體功能或作為天然蛋白酶體抑制劑誘導PCa 細胞凋亡［7，15］。本研究發現，CA 可呈濃度依賴性抑制PC-3細胞的增殖，其24 h 的IC50值約為19 μmol/L。此外，Transwell、基質黏附及成球實驗結果提示CA 可在體外抑制PC-3細胞的遷移、侵襲、黏附及成球能力。

PCa 的轉移和進展是受多種機制調節的復雜過程。miRNAs 可通過轉錄后抑制的方式發揮抗腫瘤作用，Argonaute2（AGO2）蛋白作為RNA 誘導沉默復合體的核心成分，可與miRNAs 之間相互調控進而影響腫瘤的發生發展［16］。研究報道，CA 抑制腫瘤的惡性生物學行為與其可調控miRNA 的表達有關［8，17］。既往研究發現，miR-143 是PC-3細胞遷移侵襲的負向調控因子，且AGO2 可與miR-143結合［10，11，18］。本研究通過qRT-PCR 發現CA 可上調PC-3細胞中miR-143 的表達，并抑制AGO2 mRNA的表達；此外，過表達miR-143 后PC-3細胞中AGO2表達明顯下調，提示miR-143 可調控AGO2 的表達。本研究進一步探討CA 抗PC-3細胞活性的作用機制，結果發現CA、過表達miR-143 及沉默AGO2 均能抑制PC-3細胞的遷移、侵襲及黏附能力；功能回復實驗提示，過表達AGO2 可逆轉CA 及miR-143 對PC-3細胞遷移、侵襲及黏附的抑制作用。上述結果說明，CA可能通過上調miR-143/Ago2軸抑制PC-3細胞的遷移、侵襲及黏附。

腫瘤干細胞具有很強的遷移及侵襲能力，此外，當PCa 細胞由上皮表型向間質表型轉化時，腫瘤的侵襲及轉移能力也會明顯增強［19］。因此，抑制干細胞特性及EMT 可成為抑制PCa 骨轉移潛在治療方式［20-21］。研究發現CA 可以通過逆轉非小細胞肺癌的EMT 過程來抑制腫瘤細胞黏附及生長［22］。本研究發現，CA 可濃度依賴性抑制PC-3細胞的成球能力，并抑制PC-3細胞中EMT及干細胞特性相關蛋白的表達，說明CA 對PC-3細胞的EMT及干細胞特性具有抑制作用。此外，上調miR-143 后PC-3細胞中N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白、ZEB1 及CD44+、Oct-4、c-Myc 表達水平均明顯降低。綜合上述研究結果，本研究推測CA 可抑制PC-3細胞的EMT及干細胞特性，其機制可能與其能上調miR-143/AGO2 軸有關。

綜上所述，本研究表明CA 可在體外抑制PC-3細胞的增殖、遷移、侵襲及黏附能力；CA 還可抑制PC-3細胞的EMT及干細胞特性，其機制可能與其能上調miR-143/AGO2 軸有關。本研究主要探索了CA 在體外對PC-3細胞惡性生物學行為的抑制作用，尚未探討miR-143/AGO2 軸在CA 抑制PCa 骨轉移生長與轉移中的詳細作用機制和體內抑瘤效果，因此在下一步研究中將會重點對其展開研究，以期為CA 作為抗PCa 骨轉移的潛在治療藥物提供前期實驗參考。

【Author contributions】Wu Junxi wrote the article.TANG Yubo，LINGHU Xitao and BAO Guanglong performed the experiments.SHI Haoran and WEN Zhenyu collected data.HUANG Shuai and WA Qingde designed the study.All authors read and aplproved the final manuscript as sub-mitted.