基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的植物源性食品中乙基多殺菌素殘留測(cè)定

摘 要 應(yīng)用QuEChERS前處理方法，以植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）為樣品，經(jīng)乙腈提取、鹽析離心后取上清液，用乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）分散固相萃取凈化、離心后溶劑交換制成待測(cè)液，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。在經(jīng)過(guò)儀器條件和樣品前處理優(yōu)化后，乙基多殺菌素在0.005～0.200 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均滿足0.999。在3個(gè)水平濃度下，平均回收率為87.2%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.9%。表明應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測(cè)定植物源性食品中乙基多殺菌素殘留量的分析方法簡(jiǎn)單易行、回收率和重復(fù)性良好，可滿足植物源性食品中乙基多殺菌素殘留監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；植物源性食品；乙基多殺菌素；殘留量

中圖分類號(hào)：O657.7+2；TQ453 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.19.037

乙基多殺菌素可以有效防治鱗翅目幼蟲(chóng)、薊馬、潛葉蠅、小菜蛾、甜菜夜蛾、豆莢螟等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，并具有廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)[1-3]。乙基多殺菌素產(chǎn)品自2009年4月首次在我國(guó)農(nóng)藥登記以來(lái)，廣泛應(yīng)用于植物源性食品中[4-8]，隨之帶來(lái)了乙基多殺菌素植物源性食品中殘留的問(wèn)題[9-11]。因此，關(guān)于乙基多殺菌素在各類植物源性食品中的安全評(píng)價(jià)受到越來(lái)越多的關(guān)注。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763）是根據(jù)我國(guó)農(nóng)藥殘留試驗(yàn)及監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)、居民膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)、農(nóng)藥毒理學(xué)數(shù)據(jù)等，經(jīng)過(guò)科學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后制定的，是開(kāi)展農(nóng)藥安全性評(píng)價(jià)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的技術(shù)判定依據(jù)，也是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分和保障食品安全、保護(hù)公眾身體健康的重要措施。現(xiàn)行有效GB 2763—2021與首次發(fā)布的GB 2763—2012相比，對(duì)食品中乙基多殺菌素最大殘留限量由1個(gè)類別3個(gè)品種增加到8個(gè)類別48個(gè)品種，最大殘留限量范圍從（0.1～0.5）mg·kg-1到（0.01～10）mg·kg-1。由此可見(jiàn)，我國(guó)對(duì)部分品種的乙基多殺菌素最大殘留限量要求越來(lái)越嚴(yán)，因而建立測(cè)定植物源性食品中乙基多殺菌素殘留量的分析方法具有重要意義。

乙基多殺菌素農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)分析方法主要有液相色譜法（liquid chromatography，LC）[12-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16-23]，但目前樣品基質(zhì)主要圍繞土壤、藥材植物（黨參、枸杞）、谷物（水稻）和動(dòng)物源性產(chǎn)品（牛奶、雞肉、豬脂肪）等開(kāi)展研究，對(duì)植物源性產(chǎn)品基質(zhì)中乙基多殺菌素農(nóng)藥殘留量檢測(cè)分析的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。QuEChERS預(yù)處理方法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在植物源性產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)分析[24-28]。應(yīng)用QuEChERS方法建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測(cè)植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）中乙基多殺菌素殘留的分析方法，可以為植物源性食品中乙基多殺菌素殘留監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與材料

1.1.1" 儀器設(shè)備與試劑

XEVOTQ-S高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）、Practum2102電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）和3-18K高速離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）。

乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度88.84%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH生產(chǎn)）、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司生產(chǎn)）、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司生產(chǎn)）、氯化鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary secondary amine，PSA）（美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)）、陶瓷均質(zhì)子（美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)）和微孔濾膜（美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)）。

1.1.2" 試驗(yàn)材料

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）對(duì)乙基多殺菌素的食品種類范圍，以及農(nóng)業(yè)部公告2386號(hào)《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》[29]對(duì)植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法制定過(guò)程中基質(zhì)材料選擇要求，結(jié)合截至2023年2月28日中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)，目前我國(guó)有效期登記共有3個(gè)乙基多殺菌素產(chǎn)品，其中蔬菜作物有豇豆、黃瓜、玉米、甘藍(lán)、茄子，水果作物有西瓜、葡萄、楊梅樹(shù)、芒果。因此，選用蔬菜樣品基質(zhì)為甘藍(lán)、茄子，水果樣品基質(zhì)為葡萄，食用菌樣品基質(zhì)為香菇。

1.2" 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" 樣品前處理

稱取10.00 g植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）試樣于50 mL塑料離心管中，加入20.0 mL乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈震蕩1 min，加入5 g氯化鈉，劇烈震蕩1 min后，4 200 r·min-1離心5 min，移取3 mL提取液于15 mL離心管中，加入150 mg PSA，渦旋1 min后，4 200 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確移取2 mL上清液于玻璃離心管中，在40 ℃水浴下氮?dú)饩徛抵两桑尤?.00 mL甲醇-水（體積比1∶1）溶液，旋渦混合1 min溶解殘留物，過(guò)微孔濾膜，制成上機(jī)待測(cè)液。

1.2.2" 乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶劑溶解并定容至10.00 mL，配制成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光-18 ℃以下條件保存。

吸取2.00 mL的1 000 mg·L-1的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中用乙腈定容至100.00 mL，配制成20.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光-18 ℃以下條件保存。

1.2.3" 儀器條件

1）色譜條件。流動(dòng)相A為鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸溶液），流動(dòng)相B為甲醇，色譜柱ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm 2.1 × 50 mm），柱溫45 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速0.250 mL·min-1，流動(dòng)相梯度0～1 min，B 10%；2～3 min，B 25%；5～6.5 min，B 45%～60%；7.5～8.5 min，B 60%～75%；9～10 min，B 90%～95%；11～12 min，B 95%；12～14 min，B 10%。

2）質(zhì)譜條件。電離模式ESI+，毛細(xì)管電壓3.0 kV，干燥氣溫度450 ℃，干燥氣流速900 L·h-1，錐孔氣流速150 L·h-1，霧化壓力7 Bar，碰撞氣流速0.15 mL·min-1。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1" 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)乙基多殺菌素的分子結(jié)構(gòu)特性，采用正離子模式掃描，由于乙基多殺菌素有乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L兩種本體[30-31]，需分別優(yōu)化其質(zhì)譜參數(shù)。分別手動(dòng)找到目標(biāo)化合物的母離子后，運(yùn)用儀器自帶的Interllistart功能優(yōu)化其離子對(duì)最佳的碰撞能量。乙基多殺菌素2種本體的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.1.2" 色譜條件的優(yōu)化

常用的流動(dòng)相溶劑有乙腈和甲醇，由于乙腈和甲醇都是易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，且乙腈的毒性較大，基于對(duì)檢測(cè)人員健康考慮，試驗(yàn)選擇甲醇-水，甲醇-0.05%甲酸水溶液，甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨 + 0.05%甲酸溶液）3種溶液作為流動(dòng)相體系進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨 + 0.05%甲酸溶液）為流動(dòng)相時(shí)，乙基多殺菌素響應(yīng)值較好。經(jīng)優(yōu)化流動(dòng)相梯度得到保留時(shí)間適中、峰型良好的色譜圖。因此，HPLC-MS/MS法選擇甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨 + 0.05%甲酸溶液）為流動(dòng)相。

2.2" 樣品前處理的優(yōu)化

基于QuEChERS方法，結(jié)合乙基多殺菌素的特性、植物源性食品基質(zhì)背景特點(diǎn)和對(duì)環(huán)境友好等因素，對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化。乙基多殺菌素對(duì)酸和堿不敏感，故無(wú)需使用緩沖體系。乙腈和甲醇對(duì)乙基多殺菌素均有足夠的溶解性，而乙腈的毒性比甲醇的大，基于對(duì)環(huán)境友好的考慮，復(fù)溶溶劑選擇甲醇-水（1∶1）。蔬菜、水果和食用菌的主要干擾物質(zhì)是色素、糖類和有機(jī)酸等物質(zhì)，而乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）有去除色素、糖類、有機(jī)酸等極性物質(zhì)的作用。試驗(yàn)提取包選擇4 g無(wú)水硫酸鎂 + 1 g氯化鈉、5 g氯化鈉。凈化包選擇100 mg PSA、150 mg PSA、200 mg PSA。結(jié)果表明2種提取包都能有效去除樣品中的水分，考慮到加入無(wú)水硫酸鎂時(shí)會(huì)迅速結(jié)塊，對(duì)后續(xù)的振蕩混勻帶來(lái)一定的阻力，因而考慮選擇5 g氯化鈉作為提取包。100 mg PSA凈化后的試樣顏色較另外兩個(gè)含量稍微深一些，用200 mg PSA凈化后的試樣乙基多殺菌素-L回收率在70%～80%，用150 mg PSA凈化后的試樣乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L回收率均可達(dá)到80%。因此，HPLC-MS/MS法選擇5 g氯化鈉和150 mg PSA。

2.3" 減小基質(zhì)效應(yīng)的影響

通常采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的ESI源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)一般會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)。為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，試驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)定量，即用不含乙基多殺菌素的空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶劑。

2.4" 線性關(guān)系和定量限

取上述配制的20.0 mg·L-1的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，不含乙基多殺菌素的空白樣品提取液為溶劑分別配制成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在儀器條件優(yōu)化好的設(shè)備上機(jī)測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值峰面積Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)如表2所示。根據(jù)歐盟殘留監(jiān)控指南的規(guī)定，當(dāng)化合物某一濃度的信噪比＞10時(shí)，即可作為定量限。

2.5" 回收率和精密度

采用在不含乙基多殺菌素的空白樣品中加標(biāo)的方法，測(cè)定回收率來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確率。選擇3個(gè)水平濃度，每個(gè)水平濃度重復(fù)進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，得到的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示。數(shù)據(jù)表明，方法的回收率范圍為87.2%～98.8%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.9%，能夠滿足日常檢測(cè)需求。

3" 小結(jié)

建立以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）中乙基多殺菌素殘留量的分析方法，驗(yàn)證該分析方法的靈敏度、回收率和重復(fù)性等技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明，該方法精密度和準(zhǔn)確性良好，可以達(dá)到乙基多殺菌素定性和定量的分析要求，適用于植物源性食品中乙基多殺菌素殘留的實(shí)際監(jiān)測(cè)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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