基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究金芪降糖片治療2型糖尿病作用機(jī)制

趙夢瑤 潘芊鈺 曹 穎

天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種代謝疾病，長期表現(xiàn)出高血糖的水平，受遺傳因素和環(huán)境因素等多因素長期作用的影響，臨床表現(xiàn)為血中的葡萄糖水平維持在較高的狀態(tài)，多飲、多食、多尿、消瘦等。調(diào)查研究表明，目前我國糖尿病患病率較高，為11.2%[1]。因T2DM早期癥狀隱匿、并發(fā)癥多，涉及神經(jīng)、心腦血管等多個全身系統(tǒng)，且T2DM常引起并發(fā)癥，如高血壓、腎臟疾病等，嚴(yán)重危害國民健康。

中醫(yī)藥治療T2DM旨在治療“消渴”病癥。隨著中醫(yī)對T2DM的觀察研究，提出可以根據(jù)病程將T2DM分為四個時期：脾癉；（熱中）消中、鬲消、腎燥；消渴；消癉[2]。經(jīng)過長期的治療和探索，中醫(yī)前輩們總結(jié)出了以下幾種辯證論治：肺熱傷津，潤肺生津?yàn)橹鳎磺鍩嵘颍鏆怵B(yǎng)陰為主；益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)益脾腎為主[3]。同時采用分時論治，單藥治療，針灸療法等治療手段。金芪降糖片是基于《備急千金要方》中的復(fù)方黃連丸結(jié)合現(xiàn)代臨床研究開發(fā)的中成藥，臨床上用于治療糖尿病安全且有效，有清熱益氣的功效，多用于治療口渴多飲、氣短乏力的氣虛內(nèi)熱型消渴病[4]。臨床上金芪降糖片對輕、中型非胰島素依賴型糖尿病能達(dá)到良好的治療效果，但其作用機(jī)制尚不完全明確[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)、藥理學(xué)等多種學(xué)科，基于多種數(shù)據(jù)庫能夠初步揭示中藥有效成分與疾病之間的關(guān)系[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步研究金芪降糖片治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)的作用機(jī)制，為臨床研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 金芪降糖片活性成分篩選及其作用靶點(diǎn)的預(yù)測

選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫，以金芪降糖片中三味中藥作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到活性成分及作用靶點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）。將得到的有效成分進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)收集，得到的關(guān)鍵成分代入有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）檢索得到每個成分的分子結(jié)構(gòu)式，通過小分子藥物靶點(diǎn)預(yù)測在線平臺數(shù)據(jù)庫（Swiss Target Prediction）對每個成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，使用蛋白質(zhì)（Uniprot）數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)基因名進(jìn)行規(guī)范。

1.2 T2DM靶點(diǎn)的獲取

以“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞，使用OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫，檢索T2DM的靶點(diǎn)，整合相關(guān)靶基因并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.3 金芪降糖片治療T2DM潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

通過Venny 2.1工具分析1.1和1.2項(xiàng)下得到的數(shù)據(jù)集并繪制韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)，即金芪降糖片作用于T2DM的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件對金芪降糖片活性成分及治療T2DM的預(yù)測靶點(diǎn)構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入1.3項(xiàng)下得到的交集靶點(diǎn)，設(shè)置物種為“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）為0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cystoscap 3.7.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑢PI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)評價(jià)，分值大于平均分的基因即為金芪降糖片T2DM的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析

使用基因富集分析工具David 6.8，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為P＜ 0.05，對上述得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入分析工具，對其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并將結(jié)果可視化處理，繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 金芪降糖片活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索并進(jìn)行條件篩選，得到金芪降糖片活性成分371個，黃連48個，黃芪87個，金銀花236個。因每個成分可以作用于多個靶點(diǎn)，因此所得靶點(diǎn)存在重復(fù)值，合并數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果去重后，共得到活性成分54個，相關(guān)靶點(diǎn)697個。

2.2 T2DM潛在靶點(diǎn)預(yù)測

檢 索OMIM數(shù) 據(jù) 庫、GeneCards數(shù) 據(jù) 庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫，匯總整理各數(shù)據(jù)庫結(jié)果并剔除重復(fù)靶點(diǎn)，累計(jì)得到T2DM潛在靶點(diǎn)838個，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫修正全部靶點(diǎn)基因名。

2.3 金芪降糖片治療T2DM潛在作用靶點(diǎn)

將上述得到的藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到86個共同靶點(diǎn)，即為金芪降糖片治療T2DM的潛在靶點(diǎn)，通過Venny 2.1繪制韋恩圖（圖1）。

圖1 金芪降糖片與T2DM靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.7.2軟件中導(dǎo)入2.1項(xiàng)下的54個活性成分與2.3項(xiàng)下的86個交集靶點(diǎn)，剔除與T2DM靶點(diǎn)無關(guān)成分的相關(guān)靶點(diǎn)，繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將2.3項(xiàng)下的86個交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，下載TSV文本數(shù)據(jù)結(jié)果，再代入Cytoscape 3.7.2對結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。以度、介數(shù)中心性、平均最短路徑長度、接近中心性4個參數(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行篩選，共86個節(jié)點(diǎn)、813條邊，平均度值為18.9，節(jié)點(diǎn)平均介數(shù)中心性為0.595。以度值進(jìn)行排序，得到37個靶點(diǎn)分值大于平均分，將排名前30的靶點(diǎn)使用R 3.6.1繪制條形圖（圖4）。

圖3 金芪降糖片與T2DM關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序（排名前30）

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

對86個共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析得到1855個GO條目（P≤0.05），結(jié)果顯示，主要富集于生物學(xué)過程（biological process，BP），共1722條富集條目，包括肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽激素反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、絲氨酸磷酸化等（表1）；細(xì)胞組分（cellular component，CC）有32條富集條目，靶點(diǎn)參與最多的是主要作用于膜筏、膜微區(qū)；分子功能（molecular function，MF）有101條富集條目，參與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等過程。選取排名前10的GO條目繪制氣泡圖（圖5）。

圖5 金芪降糖片治療T2DM的GO富集分析

表1 金芪降糖片治療T2DM的GO生物過程分析

KEGG富集得到147條信號通路，將排名前20的通路可視化，繪制氣泡圖（圖6），顏色越紅表明顯著性越高，關(guān)鍵通路有癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、胰島素抵抗HIF-1信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗等。

圖6 金芪降糖片治療T2DM的KEGG富集分析

3 討論

金芪降糖片是治療消渴癥的經(jīng)典名方，方中具有苦寒藥性的黃連為君藥，有清中焦?jié)駸帷a火解毒的功效，以甘溫藥性的黃芪做為臣藥來調(diào)和藥性，黃芪善補(bǔ)肺氣、益衛(wèi)氣，有提升運(yùn)轉(zhuǎn)之功，可調(diào)節(jié)臟腑功能，補(bǔ)脾健胃。金銀花藥性甘寒，長于清熱解毒，在方中作為佐藥，可以輔助黃連來增強(qiáng)清熱瀉火之效，諸藥配伍精妙，共奏益氣固本、標(biāo)本兼治之功[7]。臨床用于治療以口渴多飲、氣虛乏力為表征的T2DM，療效較為理想[8]。大多數(shù)糖尿病患者的病因未知，但常伴有炎癥過程，破壞免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等。方中黃連中的小檗堿、木蘭花堿；黃芪中的黃芪甲苷；金銀花中的咖啡酸、綠原酸、木犀草苷等，可以起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用[9]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選了金芪降糖片的54個有效成分，預(yù)測86個治療T2DM的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)PPI拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等可能是金芪降糖片發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可以通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)途徑，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)血脂、血糖水平等作用，從而可以用于輔助治療T2DM[10]。MAPK1會在腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)劑在骨骼肌細(xì)胞激活，還參與了細(xì)胞的增殖、基因表達(dá)分化、存活和凋亡等多種免疫調(diào)節(jié)，免疫反應(yīng)可以調(diào)節(jié)糖尿病患者的高血糖、氧化應(yīng)激、生長因子等水平[9]。因此，推測金芪降糖片通過作用于核心靶點(diǎn)，參與多種生物過程發(fā)揮降糖作用。GO功能富集分析顯示，在生物過程中肽基酪氨酸磷酸化和修飾起到重要作用，肽基酪氨酸是胰島素受體和胰島素受體底物中的重要成分。整個過程首先是肽基酪氨酸磷酸化，從而會使受體底物上的酪氨酸被殘基化，其次磷酸化的P13K被激活后會作用于AKT，結(jié)果會導(dǎo)致細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙分子層磷酸化，血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)來達(dá)到降低血糖的目的[11-12]。在細(xì)胞組分中，重點(diǎn)通路集中在膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)，并且細(xì)胞膜是這三種細(xì)胞組分主要存在的位置，細(xì)胞膜上富含多種離子通道與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中與T2DM有關(guān)的離子通道、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體包括鈣離子通道、ATP敏感型鉀離子通道、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體等[13]。由此推測金芪降糖片中的活性成分通過影響細(xì)胞膜上膜筏、膜區(qū)和膜微區(qū)上離子通道及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，影響葡萄糖從血液到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響肝糖原、肌糖原的合成[14]。分子功能中通路是蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶作為Rho家族中GTP酶的重要效應(yīng)物，能夠參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和動力學(xué)[13]。黃連素為黃連、黃芪中的主要成分，可以作用于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶靶點(diǎn)，其主要目的是影響細(xì)胞膜上的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)體，減輕胰島素抵抗[9]。

綜上，推測金芪降糖片通過多途徑協(xié)同發(fā)揮降糖作用。KEGG通路結(jié)果表明，其最主要的通路是癌癥中的蛋白多糖，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和直接殺傷腫瘤細(xì)胞，參與相關(guān)細(xì)胞代謝、免疫反應(yīng)等生理活動。癌癥中的蛋白多糖能夠改善細(xì)胞的糖脂代謝，抑制炎性因子釋放，進(jìn)而減輕胰島素抵抗[15]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選得到金芪降糖片治療T2DM的活性成分、靶點(diǎn)和通路，初步揭示金芪降糖片治療T2DM的作用機(jī)制。結(jié)果表明，其發(fā)揮作用是通過多通路、多靶點(diǎn)共同參與，為臨床應(yīng)用的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。