胃腸間質瘤不同中醫證型的免疫組化因子表達及臨床意義

羅教秀 儲 兵 孟鳳嬌 林綺璐

廣東省中山市人民醫院病理科，廣東中山 528403

胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是常見的間葉源性腫瘤，其在胃腸道惡性腫瘤中占1%～3%，好發于50～70歲人群[1]。其預后通常與危險程度分級、病例分期、腫瘤直徑等因素有關，近年來，人們對GIST的關注日漸提高，該疾病的診斷、治療、新藥研發等均具有諸多進展[2]。C-kit原癌基因蛋白 117（C-kit proto-oncogene protein，CD117）、CD34是診斷GIST指標中具有較高診斷價值的免疫組化標志物，抗原Ki-67是良、惡性腫瘤診斷、預后評估的指標[3]。對于GIST，我國傳統醫學中并無相關描述，而近年來有部分學者將GIST歸類于傳統醫學“息肉”范疇。基于此，本研究對60例GIST患者CD117、CD34、Ki-67的表達情況進行分析，分析其與GIST患者中醫證型的關系，旨在探討中醫不同證型之間客觀指標的差異，分析其中醫證型與相關免疫組化因子的關系，為臨床中西醫結合診斷、治療GIST提供方向。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月至2021年10月于中山市人民醫院（我院）就診的胃腸道間質瘤患者60例作為研究對象。其中男29例，女31例，年齡27～81歲，平均（57.42±6.39）歲。納入標準：①經病理學檢測確診為GIST；②符合《中醫病證診斷療效標準》[4]、《中醫常見證診斷標準》[5]中息肉相關診斷依據；③手術獲取的組織蠟片材料充足；④患者臨床資料齊全；⑤患者均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①入組前均接受過放療、化療、手術切除以及中醫藥治療等；②合并其他部位的腫瘤；③合并嚴重心、肺、腎等重要器官功能障礙；④存在精神疾病無法配合研究等。本研究已通過醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 主要設備、材料及操作方法 兔抗人CD117多克隆抗體、兔抗人CD34分子抗體、Ki-67細胞增殖檢測試劑盒均購于上海長嘉生物科技有限公司；兔抗人Ki-67多克隆抗體、通用型兩步法檢測試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液均購于上海長嘉生物科技有限公司；DAB免疫組織化學顯色試劑盒購于上海長嘉生物科技有限公司；蘇木素購自北京索萊寶科技有限公司、防脫玻片購于南通市甄選醫療科技有限公司、Roche Benchmark XT/ULTRA全自動多功能免疫組化檢測系統儀（瑞士羅氏）、RM2245是半自動輪轉式切片機（德國徠卡）、EG1160一體式石蠟包埋機（德國徠卡）；BX41光學顯微鏡（日本OLYMPUS）。操作步驟嚴格按照說明書進行：①切片。對石蠟包埋組織進行切片，切片厚度約為4 μm，每個切片3張，分為Ki-67組、CD34組、CD117組。②脫蠟。將切片浸泡在二甲苯中，每次浸泡30 min，重復2次；再放在無水乙醇中浸泡5 min，重復2次；放在95%乙醇中浸泡5 min，2次；置于濃度80%乙醇中浸泡5 min；置于75%乙醇中浸泡5 min，最后用蒸餾水沖洗5 min。③抗原修復。將切片浸泡在pH值為8的EDTA抗原修復液中，修復3 min以保持切片濕潤。用磷酸鹽緩沖液洗滌3次切片，每次3 min。④抗原修復與暴露切片。切片放在檸檬酸緩沖液中浸泡后，置于微波爐內進行加熱以修復抗原，時間12 min。隨后取出切片在室溫內冷卻，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。⑤滴加抗體。在切片上滴加適量一抗，置于4℃環境中孵育過夜。取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，在滴加相應的二抗，在室溫37℃環境中孵育60 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。⑥顯色復染。在切片上滴加顯色劑顯色3～5 min后用蒸餾水沖洗，并在切片上滴加Mayer蘇木精溶液復染1 min，水洗5 min，最后按照乙醇梯度法對切片進行脫水，并用中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化染色結果判斷標準 高倍顯微鏡下觀察，存在棕色顆粒染色細胞為陽性細胞，免疫組化指標陽性表達率計算方法：選取免疫組化染色較強的區域10個進行細胞計數，共觀察1000個細胞，陽性表達率=所觀察陽性細胞總數/1000×100%。

1.3 觀察指標及評價標準

觀察組織標本免疫組化鏡下CD117、CD34、Ki-67的表達情況；比較GIST患者不同臨床特征及中醫證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達情況；采用Spearman相關系數檢驗不同中醫證型GIST與CD117、CD34、Ki-67表達的相關性。

患者中醫證型評估標準：術前，參考《中醫常見證診斷標準》[5]對患者進行中醫證型判斷，患者中醫證型主要分為濕熱內阻、脾虛濕瘀、脾胃氣虛三種。

1.4 統計學方法

本研究采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（）表示，行t檢驗，應用Spearman系數進行相關性分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測結果

納入的60例GIST患者中，GIST組織CD117陽性率為90.00%（54/60）、CD34陽性率為81.67%（49/60）、Ki-67陽性率為 70.00%（42/60）。

2.2 GIST患者不同臨床特征及中醫證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達情況比較

不同的年齡、性別、核分裂數患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達率及不同腫瘤直徑、危險程度患者CD117、CD34陽性表達率差異無統計學意義（P＞ 0.05）；不同腫瘤直徑、危險程度患者Ki-67陽性表達率及不同中醫證型患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達率差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 GIST患者不同臨床特征及中醫證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達情況比較[n（%）]

2.3 GIST中醫證型與CD117、CD34、Ki-67陽性表達的相關性

經Spearman系數檢驗，GIST患者各中醫證型比例分別與 CD117呈正相關（P＜ 0.05），與 CD34、Ki-67陽性表達呈負相關（P＜ 0.05）。見表2。

表2 GIST中醫證型與CD117、CD34、Ki-67陽性表達的相關性

3 討論

GIST是外國學者Clark和Mazur教授于1983年首次提出[6]，是一組起源于腸道內原始的多潛能肝細胞中的腫瘤，該腫瘤具有自身特征的形態學、遺傳特性以及免疫表型等，其多向分化的特性，導致其在生物學上難以預估[7]。GIST在以往的報道中并不常見，其在胃腸道腫瘤中占比不到1%[8]，它們起源于位于肌肉層內的Cajal間質細胞，其特征在于酪氨酸激酶受體KIT的過表達[9]。未轉移的GIST的標準治療是手術切除，具有轉移的GIST通常僅通過酪氨酸激酶抑制劑治療而無法根治；因此，早期診斷是改善其預后的唯一方法。隨著我國醫學的發展，目前臨床上中西醫結合應用于GIST治療中，但關于GIST的中醫證型及患者臨床特征、免疫組化因子等相關研究仍較為少見。基于此，本研究對60例GIST患者腫瘤組織CD117、CD34、Ki-67的表達情況及其中醫證型情況進行探討，旨在為中西醫結合治療GIST提供新思路。

本研究結果顯示，CD117、CD34、Ki-67在GIST組織中均具有較高的陽性表達率，Ki-67的表達與患者預后有關。在GIST的發生，中心事件主要為C-kit原癌基因突變[9]，而CD117是C-kit的表達產物，是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，是GIST常用的免疫組化指標，對GIST具有較高的診斷特異度，其在GIST中表達陽性率為90%以上，CD34是骨髓造血干細胞抗原，是一種糖基化跨膜蛋白，在GIST中陽性表達率為70%～89%，其特異度較CD117稍差[10]，與本研究結果一致。本研究中，不同腫瘤直徑、危險程度患者Ki-67陽性表達率存在明顯差異。Ki-67是一種分布在細胞核內，與增殖細胞相關的核抗原，其被認為與細胞分裂有關，可作為一種腫瘤良惡性、侵襲行為以及預后的標志性指標，同時也是細胞分裂和增殖活動的一種標志物[11-12]。相關研究報道，Ki-67的表達水平與GIST危險程度分級存在密切的相關性[13]，與本研究結果一致。相關研究[14]報道，CD117、CD34、Ki-67在雖然GIST組織中同樣具有較高的陽性表達率，但其與患者預后無關。其中原因可能為GIST的發生與發展不是一個簡單的過程，個體之間存在差異，因此還有待進一步的研究。

中醫藥歷史悠久，在治療胃腸功能障礙方面具有獨特的優勢[15]，而中醫藥在GIST的診療中必將會占一席之地。基于此，應盡早統一GIST在中醫理論中所屬范疇，總結其中醫證型。然而，GIST在中醫理論中并無相關論述，以往臨床常以主證作為其病名，如GIST患者主訴胃脘隱痛，故有學者將其納入“胃痛”范疇；若以反酸為主訴癥狀，則被納入為“吐酸”范疇；若以胃脘脹滿為主訴癥狀，則納入“痞滿”范疇；因此，并不利于臨床對疾病的判斷。而本研究中，依據《中醫常見證診斷標準》[5]中相關證型描述，同時，林益群等[16]表明，GIST本質為脾虛，其還具有痰濕、血瘀、熱度等證，初期患者多為濕熱瘀實，久之則為正氣虛，因此本研究中所納入患者主要可分為脾胃氣虛、脾虛濕瘀、濕熱內阻三種證型。本研究中，對不同中醫證型的GIST及其CD117、CD34、Ki-67的相關性分析結果顯示，不同中醫證型患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達率存在相關性。由此可見，對GIST組織細胞CD117、CD34、Ki-67表達情況進行檢測，或可對患者中醫證型的鑒別與診斷具有一定的價值。但其中具體作用機制，仍需進一步深入研究。

綜上所述，檢測CD117、CD34、Ki-67的表達情況對GIST患者中醫證型的診斷與鑒別具有重要意義，Ki-67陽性表達與腫瘤直徑、危險程度有關，可作為評估GIST預后的一項指標。然而本研究中僅對GIST組織CD117、CD34、Ki-67三項指標進行了免疫組化檢測，僅可將GIST組織區別于其他腫瘤組織或健康組織，并未對其量化檢測；同時關于三項指標與患者中醫證型相關性的機制尚未闡明，仍需進行更深入的研究。