水稻PDL2的突變導致小穗外稃退化

趙梓鈞，吳如會，王碩，張君，游靜，段倩楠，唐俊，張新芳，韋秘，劉金艷，李云峰，何光華，張婷

水稻的突變導致小穗外稃退化

趙梓鈞，吳如會，王碩，張君，游靜，段倩楠，唐俊，張新芳，韋秘，劉金艷，李云峰，何光華，張婷

西南大學農學與生物科技學院/南方山地農業教育部工程中心，重慶 400715

【】小穗是禾本科植物特有的花器官。在水稻中，小穗作為花序的基本單位和獨有結構，對水稻的產量和品質具有重要影響。因此，研究水稻小穗和花器官的發育，為水稻產量和品質的形成提供依據。【】使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）誘變秈稻保持系西農1B，獲得2個具有相似突變表型的水稻等位突變體和（和）。由于二者表型相似，選取（命名為）為材料，通過顯微觀察和石蠟切片技術分析其小穗突變表型；通過農藝性狀考察分析小穗外稃突變對水稻產量的影響；通過圖位克隆技術驗證的功能；運用原位雜交技術及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術分析的表達模式。【】表型分析結果表明，與野生型相比，突變體外稃明顯變窄，不能與內稃緊密鉤合，導致小穗開裂，內輪花器官部分裸露在外，但其雄蕊、雌蕊和漿片的形態和數量均表現正常。進一步的石蠟切片結果表明，突變體外稃硅化細胞和泡狀細胞體積、數量的降低，以及維管束間距的減小，是導致外稃的寬度明顯變窄的原因。農藝性狀考察表明，外稃的變化最終引起籽粒呈水滴狀，并使得突變體的結實率和千粒重等產量性狀明顯下降。遺傳分析和圖位克隆結果表明，是一個單隱性核基因，是位于水稻第4染色體的。該基因編碼一個Dicer-like蛋白，在水稻ta-siRNA的合成途徑中發揮重要作用，并且突變體是的一個新的弱等位突變。利用原位雜交技術及RT-qPCR技術進行的表達模式分析和基因功能分析結果表明，在水稻各輪花器官中組成型表達，該基因的突變不會影響水稻花器官特征的形成，但會干擾水稻ta-siRNA合成，影響水稻近-遠軸極性建立相關基因的表達，從而導致突變體外稃近-遠軸極性建立紊亂?！尽克就怙嘶虻耐蛔兪沟猛怙?遠軸極性建立紊亂，影響小穗外稃的發育和產量性狀的形成。

水稻（L.）；小穗；外稃；圖位克隆；功能分析

0 引言

【研究意義】水稻（L.）是世界上最重要的糧食作物之一，其小穗的發育對水稻的產量和品質至關重要[1]。在水稻中，小穗包含1個由四輪花器組成的可育頂生小花（1個外稃和1個內稃，2個漿片，6枚雄蕊和1枚雌蕊），1對護穎和1對副護穎[2-3]。其中，外稃和內稃構成水稻的穎殼，是禾本科植物獨特的外輪花器官。穎殼的大小是種子大小的決定因素之一，其發育對水稻產量和品質的形成具有重要意義[4-5]。【前人研究進展】花器官特征基因的表達調控花器官的生長和發育，進而影響小花的形成。以往研究發現，在水稻花器官的發育過程中，有ABCDE五類基因參與，其功能與雙子葉植物相似。其中，A類和E類基因與外稃和內稃的發育有關[6]。到目前為止，已經克隆了3個A類基因。和被證明是內稃特性所必需的，二者的雙突變體表現為小穗缺失[7]。在所有組織中廣泛表達，在水稻中過量表達會導致提前開花[8]。水稻中有至少5個E類基因，其中突變體具有葉狀的外稃和內稃，漿片伸長，呈稃片狀[9]。與之相似，突變也會使小穗轉化為葉狀結構[10]。和功能冗余，二者的雙突變體漿片、雄蕊和心皮轉化為稃片狀器官[11]。突變體分枝和小穗的排列混亂，護穎和副護穎伸長，表明其對小穗發育具有重要調控作用[12]。此外，ta-siRNA的合成途徑也調控穎殼的發育。在擬南芥中，ta-siRNA的產生是由特定的miRNA- AGO復合物對TAS轉錄本上miRNA靶位點的切割引起的。斷裂的單鏈在RDR6和SGS3蛋白的作用下合成雙鏈RNA，再在DCL4蛋白的切割下生成21 nt的ta-siRNA[13-14]。在水稻的ta-siRNA合成途徑中，發揮了重要作用。該基因編碼一個Dicer-like酶，可以對雙鏈RNA進行切割，是ta-siRNA產生的直接作用蛋白[15]。突變將導致ta-siRNA途徑受阻，進而影響miR166、等近-遠軸極性發育相關調控因子的積累，最終導致水稻器官極性發育缺陷。例如，水稻編碼擬南芥DCL4的同源蛋白，外稃的發育因近軸面發育缺陷而受到阻礙，從而變成棒狀[16-17]。此外，水稻ta-siRNA合成途徑中其他基因的突變也會造成水稻外稃發育異常。在水稻中編碼擬南芥RDR6的同源蛋白，介導雙鏈RNA的產生。在突變體中，由于雄蕊和外稃的近-遠軸極性發育的缺陷，外稃退化為芒狀或桿狀甚至消失[18-19]。編碼擬南芥AGO7的同源蛋白，它能特異性地與miRNA結合并參與ta-siRNA的合成。發芽后葉片異常，莖頂端分生組織變扁平，外稃呈芒狀，內稃退化[20]。由此可見，水稻ta-siRNA合成途徑可以通過調控穎殼和葉片的極性來影響其形態發育?！颈狙芯壳腥朦c】盡管已有較多水稻小穗發育相關基因已被克隆，但這些基因的調控網絡以及與水稻產量的關系仍需進一步完善?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用EMS誘變水稻秈稻保持系西農1B，得到2個水稻外稃退化等位突變體和，二者外稃明顯變窄，不能與內稃緊密鉤合，導致小穗開裂，內輪花器官部分裸露在外。由于二者表型相似，選取（命名為）進行深入研究，并通過表型分析、農藝性狀考察、圖位克隆、表達模式分析等方法對進行克隆和功能分析，探究在調控水稻外稃發育和產量形成中的作用，為水稻產量和品質的形成提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年7月至2022年6月在西南大學水稻研究所開展。水稻小穗突變體是利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）誘變水稻秈稻保持系西農1B獲得，其經過多代自交至性狀能夠穩定遺傳。所用試驗材料均來自于西南大學水稻研究所和海南試驗田。

1.2 形態學與組織學分析

取開花期野生型和突變體幼穗。在體視顯微鏡下進行解剖，觀察小穗、花器官的形態。用掃描電子顯微鏡（Hitachi SU3500）在-40℃冷凍條件下觀察小穗及花器官形態。

石蠟切片被用于組織學分析。分別取不同時期的野生型和突變體小穗并快速放進FAA固定液中，抽真空后置于4℃保存24 h。經乙醇逐級脫水及二甲苯進行透明處理后，再進行浸蠟和包埋。將樣品切成8 μm的切片，用番紅-固綠對染法進行染色后封片。42℃烘箱烘片2 d，利用光學顯微鏡（Nikon E600）進行觀察并拍照。

1.3 圖位克隆

1.3.1 遺傳分析 在試驗田配制突變體與秈稻56S的雜交組合，統計F1和F2性狀，利用χ2檢驗分析正常表型和突變表型的分離比。

1.3.2 連鎖分析 在開花期，從×56S的F2分離群體中隨機挑選10株正常表型單株與10株突變表型單株構建正常池和突變池，用CTAB法提取2個基因池和親本DNA。利用研究所長期保存的均勻分布在水稻12條染色體的SSR及InDel引物、Vector NTI Advance 11.5軟件和Gramene數據庫（http://www. gramene.org/microsat）篩選親本間的多態性。

1.3.3 基因定位和連鎖圖譜構建 從試驗田中挑選出F2中的突變表型單株，每個單株取幼嫩葉，采用堿煮法快速提取DNA。用1.3.2中已經篩選出的連鎖引物對定位群體進行PCR擴增。隨后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，進行目的基因的初步定位。在已確定的初步定位區間內進一步開發InDel標記，從而精細定位目的基因。

1.4 轉基因互補驗證

構建并轉化候選基因互補載體，將經過GUS染色鑒定的陽性植株種植于歇馬西南大學水稻研究所基地，在成熟期分析轉基因植株的表型。從gramene數據庫下載候選基因序列。使用Vector NYI Advance 10設計正向引物PDL2com-F和反向引物PDL2com-R，以野生型DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經凝膠提取試劑盒（天根生化技術公司）進行純化。用互補載體pCAMBIA1301原菌液進行搖動復制，提取質粒，用Ⅰ和Ⅰ限制性內切酶進行酶切，用重組酶進行連接和轉化，選擇陽性菌株送至重慶清科公司進行測序。采用農桿菌介導法將構建的載體轉入2突變體。轉化和分化過程由武漢博源公司完成。引物序列見電子附表1。

1.5 RT-qPCR分析

利用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化技術公司）提取總RNA。用帶有gDNA Eraser（TaKaRa）的PrimeScript試劑盒將純化后的RNA反轉錄成cDNA。以此為模板，加入引物混合物、SYBR Green熒光染料和無RNase水，每個組合設置3個重復，以為內參基因，使用Bio-Rad熒光定量PCR儀進行擴增。RT-qPCR分析所用引物序列見電子附表1。

1.6 原位雜交

設計引物，制備探針模板，使用羅氏DIG RNA Labelling Kit，體外合成帶地高辛標記的RNA探針（引物序列見電子附表1）。切片的預處理、雜交和免疫學檢測均按照Sang等[21]方法進行。

2 結果

2.1 開花期pdl2突變體的表型分析

與野生型相比，突變體的外稃退化，整體變窄，輕微彎折，無法與內稃鉤連，形成開裂狀小花，使得部分內輪花器官裸露在外（圖1-A、圖1-B、圖1-J和圖1-K）。剝去穎殼后，可以觀察到花器官內部的雄蕊、雌蕊和漿片的形態和數量均表現正常（圖1-C和圖1-L）。掃描電鏡結果顯示，突變體內外稃表層細胞及毛狀結構與野生型無異（圖1-D—F和圖1-M—O）。石蠟切片分析結果顯示，雖然突變體小花的外稃與野生型一樣都具有4層細胞，但突變體外稃的硅化細胞數量減少，泡狀細胞的體積、數量均顯著降低，維管束間距減小，從而導致外稃的寬度明顯變窄，使之不能與內稃緊緊鉤連，最終造成穎殼開裂，內輪花器官暴露在外（圖1-G—I和圖1-P—R）。綜上所述，突變體的外稃退化，表明對水稻外稃發育具有重要影響。

A—C：野生型小穗（A）、剝去內稃（B）、剝去外稃和內稃（C）體視鏡照片；D—F：野生型小穗（D）、外稃（E）、內稃（F）掃描電鏡照片；G—I：野生型小穗橫切面（G）及外稃（H）、內稃（I）局部放大；J—L：pdl2小穗（J）、剝去內稃（K）、剝去外稃和內稃（L）體視鏡照片；M—O：pdl2小穗（M）、外稃（N）、內稃（O）掃描電鏡照片；P—R：pdl2小穗橫切面（P）及外稃（Q）、內稃（R）局部放大。紅色方框表示放大范圍；紅色星號表示維管束。le：外稃；pa：內稃；rg：副護穎；sl：護穎；st：雄蕊；pi：雌蕊；lo：漿片；mrp：內稃邊緣；bop：內稃主體。下同。A—D、J—M的標尺=2 mm；E—F、N—O的標尺=400 μm；G—I、P—R的標尺=200 μm

2.2 pdl2突變體植株的農藝性狀分析

在成熟期，與野生型相比，株型整體緊湊，葉片直立（圖2-A）；穗型較直立，且絕大部分一次分支靠近基部約1/3的長度無小穗著生（圖2-A—B）；成熟籽粒的穎殼開裂，糙米上窄下寬，呈水滴狀（圖2-C—D）。對野生型及突變體進行考種統計，發現相較于野生型，株高減少了0.03 cm，穗長增加了0.09 cm，均無顯著差異（圖2-E—F）；一次分枝數量減少了10.7%，達到顯著水平，二次分枝數量減少了12.5%，結實率降低了53.9%，均達到極顯著水平（圖2-G—I）。籽粒長度與野生型相差不大甚至略微增加，但其糙米粒長比野生型縮小了21.6%（圖2-J—K）；籽粒寬度增加了19.0%，糙米粒寬減少了22.2%（圖2-L—M）。剝殼前千粒重和糙米千粒重分別減少了72.8%和78.3%（圖2-N—O），均達到極顯著水平。因此，在水稻小穗發育中起著重要作用，進而直接影響籽粒形成，改變水稻產量。

2.3 小穗發育早期的形態學觀察

利用掃描電子顯微鏡對野生型和突變體小穗的發育早期進行觀察。Sp4時期，野生型小穗的外稃和內稃原基先后開始發育，突變體也發育正常（圖3-A和圖3-E）。Sp5—Sp6時期，野生型小穗的外稃和內稃鉤連在一起，此時期同時形成5個球形雄蕊原基；而突變體小穗的花器官發育正常，但外稃明顯變窄（圖3-B和圖3-F）。Sp7時期，野生型小穗的外稃進一步發育，雌蕊原基開始發育，而突變體小穗的外稃相較于野生型和上一時期則變得更窄（圖3-C和圖3-G）。Sp8時期，野生型小穗的內外稃徹底鉤合在一起，將內輪花器官緊緊包裹在內，而突變體小穗外稃明顯變窄，內外稃無法緊密鉤連，不能包裹內輪花器官（圖3-D和圖3-H）。整個發育階段內，突變體小穗的內輪花器官均發育正常。綜上，突變體外稃的退化缺陷在小穗發育早期就已顯現出來。

A—D：野生型和pdl2株型（A）、穗型（B）、籽粒（C）、糙米（D）；E—O：野生型和pdl2相關農藝性狀統計。P值通過學生氏t檢驗確定。*：P≤0.05；**：P≤0.01；ns：無顯著性差異。下同

2.4 PDL2的圖位克隆

用56S與突變體進行雜交，F1表現正常，F2群體出現突變表型分離。在2 011株F2植株中，共有正常表型1 493株，突變表型518株，經卡方檢驗，分離比符合3﹕1（χ2=0.58＜χ20.05, 1=3.84），表明突變體的表型由一個單隱性核基因控制。以F2群體中的518個隱性單株作為定位群體，利用SSR標記進行基因初步定位，發現候選基因與第4染色體的SSR標記RM3524和RM5320連鎖（圖4-A）。進一步開發InDel引物（引物序列見電子附表2）對進行精細定位，最終將定位在第4染色體ln1-25.30和ln1-25.56之間約186 kb的區間內（圖4-B—C）。根據Gramene網站提供的基因注釋信息，在該區間內共有30個注釋基因（圖4-D）。通過對這30個基因進行分析，發現其中包含（），而已有研究表明，該基因編碼Dicer like蛋白，參與水稻ta-siRNA的合成，進而調控水稻穎殼極性發育。因此，通過對序列進行分析，發現突變體在第14個外顯子上發生單堿基替換，使得亮氨酸突變為脯氨酸；突變體第16與第17個外顯子之間的內含子的邊緣區域發生了單堿基替換（圖4-E—F）。進一步構建包含全長序列的互補載體，并轉入突變體。結果表明，陽性轉基因植株小穗恢復正常，與野生型相似（圖4-G）。綜上，是的一個新的等位基因。

2.5 PDL2的表達模式分析

通過RT-qPCR分析，在根、莖、葉、鞘、穗等多種組織中均組成型表達，且在小穗中表達量最高（圖5-A）。進一步分析在小穗各輪花器官中的表達情況，發現其在外稃、內稃、雌蕊、雄蕊和漿片中均表達（圖5-B）。為了更詳細地分析的表達模式，進行原位雜交試驗，發現其在水稻小穗分生組織中存在強烈信號（圖5-C—F）。Sp4時期，內稃開始發育，在護穎、外稃、內稃中高度表達（圖5-C）。在Sp5時期，在護穎、副護穎、內外稃及分生組織中均有所表達。Sp5時期后，漿片、雄蕊、雌蕊依次開始形成，在這些部位均檢測到強烈的信號（圖5-D—F）。結果表明，在各輪器官中組成型表達。

2.6 花器官發育特征基因的表達分析

為了研究突變體的花器官特性，采用RT- qPCR檢測花器官發育特征基因在野生型和突變體中的表達情況。是一種外稃特征基因，主要在野生型和突變體的外稃和內稃中表達（圖6-A）。和是外稃和內稃特征基因，在野生型和突變體的外稃、內稃中均能檢測到這兩個基因的信號（圖6-B—C）。以上結果表明，突變體外稃的形態和大小雖發生改變，但特征仍然存在。是內稃邊緣區特征基因，其在野生型和突變體的內稃中均有表達，表明突變體的內稃特征正常（圖6-D）。和在雄蕊、雌蕊及漿片的發育中發揮重要作用，這兩個特征基因在野生型和突變體的雌蕊中均有顯著表達，表明突變體的雄蕊和雌蕊發育正常（圖6-E—F）。因此，的突變對花器官的特征發育無明顯影響。

A—E：PDL2的圖位克??；F：突變位點預測；G：PDL2互補驗證。標尺=500 μm

2.7 近-遠軸極性建立特征基因的表達分析

圖位克隆結果顯示，是的一個新的等位基因。前人研究表明，是ta-siRNA合成途徑的重要基因，而ta-siRNA能對ARF（）基因進行負向調控，從而影響植物器官近-遠軸極性建立。因此，對一些決定近-遠軸極性建立的基因在野生型和突變體外稃中的表達量進行了qPCR分析。ARF基因決定遠軸面特征，對該類基因的檢測結果顯示，///在突變體中的表達量均上調，其中，和上調明顯，達到極顯著水平（圖7-A—D）。這表明突變后，可能阻礙了ta-siRNA合成途徑，從而減少了對ARF基因的抑制，進而增強了遠軸面特性。KANADI家族基因是遠軸面發育所必需的，qPCR結果顯示，在突變體中，-表達量上調，均達到極顯著水平（圖7-E—I）。因此，突變后可能導致突變體外稃近-遠軸極性建立紊亂，從而引起外稃形態發育缺陷。

A—B：PDL2的相關表達水平；C—F：PDL2在野生型小穗中的原位雜交。標尺=50 μm

A：外稃特征基因DL的相對表達水平；B—C：外稃和內稃特征基因OsMADS1（B）和OsMADS15（C）的相對表達水平；D：內稃邊緣區特征基因OsMADS6的相對表達水平；E—F：雄蕊和漿片特征基因OsMADS3（E）和OsMADS4（F）的相對表達水平

A—D：ARF家族基因的相對表達水平；E—I：KANADI家族基因的相對表達水平

3 討論

3.1 pdl2穎殼發育缺陷影響籽粒產量

由外稃和內稃共同組成的穎殼是禾本科植物所特有的外輪花器官，其形狀和大小決定籽粒的形狀和大小，直接影響了水稻產量。當穎殼發育缺陷時，內外稃無法緊密鉤合在一起，產生的籽粒大多比正常籽粒要小，種子生活力和發芽率也都降低。到目前為止，已經克隆了一些穎殼發育缺陷的突變體，如編碼類EMF1蛋白，突變體的小穗表現為內稃萎縮和糙米畸形[22]。編碼單C2H2鋅指蛋白，突變體產生不同數量的、具有不同性狀的心皮或心皮樣組織，外稃和內稃的橫向生長均受到限制，穎殼開裂而不封閉[23]。編碼一個核定位的AT鉤DNA結合蛋白，突變體內稃的主要結構被破壞，導致內稃退化為葉狀器官[24]。編碼一個DUF640蛋白，突變體的外稃彎曲，穎殼變長，不能完全關閉[25]。而本研究所討論的突變體外稃硅化細胞體積減小，泡狀細胞的體積、數量均有所降低，從而導致外稃明顯變窄，使之不能緊緊鉤連住內稃，最終造成穎殼開裂，內輪花器官暴露在外。這一突變也對籽粒產量產生了極大影響，導致糙米畸形，呈彎曲狀，粒長、粒寬及千粒重均極顯著降低。

3.2 pdl2是OsDCL4一個新的弱等位突變

本研究圖位克隆結果表明，定位于編碼Dicer like（DCL）蛋白的，該基因包含1個Helicase結構域、1個DUF283結構域、1個PAZ結構域、2個RNaseⅢ結構域和1-2個dsRBD結構域，分別參與雙鏈RNA的解旋、siRNA/miRNA鏈的選擇、RNA鏈的識別和結合、RNA鏈的切割和與其他蛋白的結合[26-27]。目前，已鑒定出數個關于該基因的等位突變體。NAGASAKI等[28]鑒定出8個水稻突變體，其中，3個突變位點位于編碼Helicase結構域的序列中，1個突變位點位于編碼PAZ結構域的序列中，1個突變位點位于編碼RNaseⅢ結構域的序列中，1個突變位點位于編碼dsRBD結構域的序列中，剩余2個突變位點位于非編碼序列中。這些突變體莖頂端分生組織不完整，發芽后葉片異常。2008年，Liu等[16]鑒定了一個突變體，該突變體在的啟動子區，5’非編碼區和第一個外顯子的前72 bp存在1 428 bp的缺失，導致其植株矮小，幼年期葉片發育異常，小穗外稃退化為棒狀，并且產生遠軸化特征。而本研究鑒定了2個全新的等位突變體和，其突變位點分別位于第14個外顯子上以及第16與第17個外顯子之間的內含子的邊緣區域，其中，前者的突變位點位于編碼DUF283結構域的序列中，后者的突變位點雖然不在外顯子區域，但其位于內含子區域的邊界處，可能影響mRNA的轉錄后修飾過程，從而產生突變表型。此外，與之前報道的突變體不同，表型分析結果顯示，為一個全新的弱等位突變，該突變體外稃部分退化，整體變窄，但并未完全退化為棒狀，仍在一定程度上保留了外稃的形態特征。因此，該突變體仍然是可育的，可以產生種子。

3.3 pdl2突變體中ta-siRNA合成途徑缺陷，導致外稃近-遠軸極性建立紊亂

編碼的Dicer-like蛋白是植物ta-siRNA途徑中必不可少的一類酶。已有研究表明，水稻ta-siRNA合成途徑相關基因的突變會引起內稃和外稃發育異常。-突變體外稃退化，轉變為棒狀[16]；突變體外稃轉變為針狀結構，芒顯著伸長，該突變體在中存在突變，而這一基因編碼水稻RdRP蛋白[18]；-突變體對溫度敏感，其外稃在外界氣溫高于32℃后退化為芒狀，且隨著溫度升高表型會越發嚴重。在上述突變體中，的表達量均有不同程度上升或在近軸面異位表達，外稃均呈現出遠軸化特性，表明在水稻中ta-siRNA合成途徑相關基因突變會導致其對的抑制效果減弱，進而產生遠軸化特征。本研究所討論的突變體中不同表達量也都上調，表明突變體外稃呈現出遠軸化特性。前人研究表明，ta-siRNA途徑缺陷影響miRNA166的積累，進而影響HD-ZIPⅢ家族基因的表達[29]。而在擬南芥中，HD-ZIPⅢ家族KANADI基因家族存在拮抗作用[30]，但二者關系在水稻中似乎未被討論。最近的一項研究表明，OsKANADI1可以促進的表達，其與tasiR-ARFs（靶基因為和的ta-siRNA）共同作用，確保表達恰當[31]。而在本研究中，表達上調，且（即）在所有中上調表達最為顯著，也為這一結論提供了新的證據。

4 結論

水稻突變體外稃退化，硅化細胞數量減少，泡狀細胞的體積、數量降低，導致其整體變窄，輕微彎曲，兩側鉤狀結構發生退化，無法與內稃緊密鉤合，形成開裂狀小花，使得部分內輪花器官裸露在外。突變體籽?；?，糙米千粒重極顯著降低。是的一個新的等位基因。突變體花器官特征仍然存在，而對近-遠軸極性建立特征基因的表達水平分析顯示突變影響外稃近-遠軸極性建立。

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Mutation ofgene causes degeneration of lemma in the spikelet of rice

ZHAO ZiJun, WU RuHui, WANG Shuo, ZHANG Jun, YOU Jing, DUAN QianNan, TANG Jun, ZHANG XinFang, WEI Mi, LIU JinYan, LI YunFeng, HE GuangHua, ZHANG Ting

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University/Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715

【】Spikelet is a unique floral organ of the grass family. In rice, the spikelet, as the basic unit and unique structure of inflorescence, has an important impact on the yield and quality. Therefore, studying the development of rice spikelets and floral organs can provide the foundation for the formation of rice yield and quality. 【】Two rice allelic mutants,and(and) with similar mutant phenotypes were obtained using Ethyl Methane Sulfonate (EMS) mutagenesis in therice maintenance line Xinong 1B. Because of their phenotypic similarity,(named) was selected as the material for further analysis. Microscopic observation and paraffin sectioning techniques were used to analyze their spikelet mutant phenotypes; agronomic trait examination was used to analyze the effect of lemma on rice yield; map-based cloning were used to verify the function of;hybridization and real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) were used to analyze the expression pattern of. 【】The results of the phenotypic analysis showed that the lemma ofmutant was significantly narrower and could not be closely hooked to the palea compared with that of wild type, resulting in spikelet dehiscence and partially exposed inner whorl floral organs. However, the morphology and number of stamens, pistils, and lodicules were normal. Further paraffin section results showed that the reduced volume and number of silicified and vesicular cells in the mutant lemma, as well as the reduced spacing of vascular bundles, were responsible for the significant narrowing of the width of the lemma in. Agronomic traits examined showed that the mutation in thelemma eventually caused the seeds to be teardrop-shaped and resulted in a significant decrease in yield traits such as seed setting rate and 1000-grain weight in themutant. Genetic analysis and map-based cloning showed thatis a single recessive nuclear gene, which isgene localized on chromosome 4.encodes a Dicer-like protein that plays an essential role in the rice ta-siRNA synthesis pathway, and themutant is a novel weak allelic mutation ofgene. The expression pattern analysis showed that thegene was constitutively expressed in all whorls of floral organs. Mutation ofaffected the ta-siRNA synthesis and the expression of genes related to the establishment of adaxial-abaxial polarity, thus leading to the disorder of adaxial-abaxial polarity establishment in the lemma of. And the characteristics of floral organs were normal. 【】Mutation of lemma degeneration genedisrupts the establishment of lemma adaxial-abaxial polarity and affects the development of lemma and the formation of yield traits.

rice (L.); spikelet; lemma; map-based cloning; functional analysis

2022-09-24；

2022-11-02

國家自然科學基金青年科學基金（31900612）、高?；究蒲袠I務費項目（SWU-KT22041）、國家級大學生創新創業訓練計劃（202210635082）

趙梓鈞，E-mail：iszhaozijun@163.com。吳如會，E-mail：996367938@qq.com。趙梓鈞和吳如會為同等貢獻作者。通信作者張婷，E-mail：tingwz@163.com

（責任編輯 李莉）