基于高通量測序對引起蘋果外觀異常病原的鑒定

李春艷，劉芳婷，張王斌

(塔里木大學/南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室/農業農村部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】蘋果(Maluspumila)薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物[1]。2019年新疆蘋果種植面積2.3×104余hm2[2]由病毒和類病毒引起的蘋果外觀異常，導致蘋果品質變劣，產量下降[3-4]。【前人研究進展】類病毒是迄今為止發現的最小病原物，是一類單鏈共價閉合環狀的裸露RNA分子,通常含330個左右核苷酸[5-7]。類病毒病害在我國蘋果上發生的主要有三個：蘋果銹果類病毒 (Apple scar skin viroid，ASSVd)、蘋果皺果類病毒 (Apple fruirt crinkle viroid，AFVCd)、蘋果凹果類病毒 (Apple scar skid viroid，ADFVd)[8]。病毒病病害在我國蘋果上發生的主要有6種[9-10]：蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV) 如蘋果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)、蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)和蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus ,ApMV)。蘋果外觀異常與蘋果銹果類病毒病病狀相似，侵染后通常表現為銹果型、花臉型、銹果-花臉混合型、環斑型和綠點型等癥狀[11-12]。已有在新疆蘋果樹、梨樹、杏樹、桃樹上蘋果銹果類病毒的報道[13-15]。【本研究切入點】有關基于高通量測序對引起新疆阿拉爾蘋果外觀異常病原的鑒定文獻較少，以高通量基因測序技術[16]為研究手段，需對引起阿拉爾蘋果外觀不同情況異常病原進行鑒定分析。【擬解決的關鍵問題】采用田間調查和高通量基因測序技術，調查與分析引起阿拉爾蘋果外觀異常的病原種類、癥狀、發生情況，確定引起阿拉爾蘋果外觀異常的病毒種類，為防治該病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2019年10月新疆阿拉爾六團一連(N40°57′42″，E80°28′49″，海拔1 070 m)不同蘋果園隨機采集6份有顯著癥狀的蘋果果實樣品和無明顯癥狀的枝條樣品。表1

表1 樣品基本信息Table 1 Basic sample information

1.2 方 法

1.2.1 發病率調查

選取新疆阿拉爾六團一連西一壟、西二壟、西三壟、西四壟地塊為調查地，在每壟各個果園中用五點取樣法分別選取40株果樹，記錄栽植信息，描述癥狀并統計發病率。表2

表2 調查地基本信息Table 2 Basic information of the survey site

1.2.2 蘋果病毒分子檢測宏轉錄組法

1.2.2.1 RNA提取

組織樣品RNA提取采用 TRizol 試劑(天根生化科技(北京)有限公司)進行提取。

1.2.2.2 建庫測序

利用帶有Oligo(dt)的磁珠對含有ploy(A)尾的mRNA富集，將mRNA打斷成短片段合成cDNA，純化后末端修復、加A尾并連接測序接頭，最后進行PCR擴增。

1.3 數據處理

使用DPS7.55軟件進行差異顯著性分析(α= 0.05)。

對原始下機數據(Raw Data)進行預處理，得到有效數據(Clean Data)。數據使用Trimmomatic軟件進行質控，質控后將得到高質量序列clean reads，然后基于有效數據進行宿主數據去除，分析病毒物種分類分析和復雜度，拼接與組裝等。

將測序得到的各病毒基因序列通過MEGA7.0構建系統發育進化樹，采用 Clustal W算法對序列進行比對，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹，自展校正值設為1000，其余使用軟件默認設置。構建進化樹的序列來自于 NCBI。表3

表3 GenBank 已登錄蘋果全長基因組的分離株Table 3 GenBank has logged into the isolates of the full length apple genome

2 結果與分析

2.1 蘋果外觀異常分類描述

研究表明，田間蘋果外觀異常表現為果實畸形型、裂果型、和著色異常型3種類型。果實畸形型：果實表面不平滑，呈縱向凹陷狀，色澤分布不均勻；裂果型：果面或果頂部出現銹斑，不規則的銹斑從蘋果頂部向四周蔓延，嚴重時果實銹斑處開裂；著色異常型:果實從著色時開始表現癥狀，在果面出現近圓形黃綠色斑塊，表現出紅黃相間的“花臉狀”，著色部分隆起，用手摸起來凹凸不平。其中黃綠色病斑面積與果實的表面積之比依次遞增。圖1～3

注:A:底部俯視圖 B:正面俯視圖 C：背面俯視圖

注:A: 黃元帥田間表現；B：新世紀正面俯視圖；C:新世紀底部俯視圖

注:A-D：短枝富士田間癥狀觀察結果

2.2 不同品種間蘋果外觀異常癥狀及發病情況

研究表明，不同品種間發病率與癥狀表現有所差異，王林的發病率最高為74.50%，與新世紀的發病率存在顯著差異，表現為畸形癥狀；其次是短枝富士，發病率為70.50%，與王林、新世紀間的發病率差異不顯著，表現為著色異常、裂果癥狀；發病率最低的為新世紀，達到了63.50%，表現為著裂果癥狀。3個品種間發病率雖有差異，但不顯著。表4

表4 不同品種間蘋果外觀異常發病率比較Table 4 Comparison of the incidence of apple appearance abnormality among different varieties

2.3 不同地塊間蘋果外觀異常發病比較

研究表明，對不同地塊間蘋果外觀異常發病率調查結果進行分析，西一壟的發病率最高為83.20%，分別與西三壟、西四壟間發病率存在顯著差異；其次是西二壟發病率78.20%，與西四壟間發病率存在顯著差異；西三龍發病率為73.20%，分別與西一壟、西四壟間發病率存在顯著差異；西四壟的發病率最低為47.20%，與其他3壟的發病率存在顯著差異。表5

表5 不同果園蘋果外觀異常發病率比較Table 5 Comparison of the incidence of abnormal apple appearance in different orchards

2.4 蘋果外觀異常病原系統進化

研究表明，在王林上檢測到5種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV；在短枝富士上檢測到3種病毒，分別為AgrCV、ASPV、ASGV；在新世紀上檢測到4種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。王林、短枝富士、新世紀都檢測到了蘋果莖溝病毒，DZFS-ASGV和WL-ASGV親緣關系最近共同聚在一個分支上，但XSJ-ASGV與相似性為63%的印度蘋果分離株(LT160740)親緣關系最近聚在另一個分支上。王林、新世紀上也檢測到了蘋果褪綠葉斑病毒，WL-ACLSV和XSJ- ACLSV與相似性為100%的分離株(M58152)親緣關系最近共同聚在一個分支上。王林、短枝富士、新世紀也檢測到了蘋果綠皺果病毒，XSJ-AgrCV和WL-AgrCV親緣關系最近共同聚在一個分支上，但DZFS-AgrCV與相似性為96%的加拿大蘋果分離株(HE963831)親緣關系最近聚在另一個分支上。王林、短枝富士、新世紀也都檢測到了蘋果莖痘病毒，但都分別聚在不同的分支上WL- ASPV與相似性為100%的日本分離株(AB045371)親緣關系最近聚在一個分支上，DZFS-ASPV與相似性為99%的印度分離株(FR694186)親緣關系最近聚在另一個分支上，XSJ-ASPV單獨為一個分支。表6，圖4

表6 蘋果外觀異常攜帶病毒種類Table 6 The apple appears to carry an abnormal virus type

圖4 蘋果分離物核苷酸序列的系統發育Fig.4 Phylogenetic analysis of nucleotide sequences from apple isolates

3 討 論

蘋果果實外觀異常原因較為復雜，已經報道的主要是蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)引起的。不同品種蘋果外觀異常田間表現癥狀不同與時丕坤[17]觀察結果一致。高通量測序技術檢測出在3種不同品種、不同表現癥狀的蘋果中均攜帶蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果綠皺果病毒(AgrCV)，李鵬舉等[18]在黑龍江省不同蘋果產區的不同品種的蘋果上也均檢測到了蘋果莖溝病毒(ASGV)。研究表明ASGV、ASPV、ACLSV在蘋果樹中呈混合侵染與楊潔萍等[19]結果一致。根據高通量測序結果顯示，檢測到的病毒有蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)和蘋果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)5種類型，并未檢測到有蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，但多病毒病的混合發生也表現出了類似蘋果銹果類病毒病的癥狀，有待深入研究。

蘋果類病毒和病毒病害目前無有效防治手段，加強果園管理可緩解病害癥狀的表現[20]，使用套袋技術可以促進蘋果果面著色、提高果實的貯藏性和果實的商品價值[21]，但無法徹底根除及解決風味變差的問題。發病率的差異可能與果園土肥水管理，土壤情況，營養不均衡，樹體衰弱，病毒容易入侵，負載量大等有關[22]。可以通過肥水管理措施，增強樹勢，提高樹體的免疫力。合理負載，平衡樹勢，減小留果密度，及時補充營養等措施減輕病害的發生[23-24]。蘋果一旦感染上病毒，很難防治，目前蘋果病毒病尚無有效的防治藥劑，只能通過預防手段加以控制，發現病株，立即拔除。培育無病毒母本，栽培無病毒苗木，加強植物檢疫是防治病毒病的有效方法[25]。

4 結 論

4.1蘋果外觀異常田間癥狀主要有果實畸形型、銹果型、著色異常型三種類型。不同品種間病害癥狀表現有所差異。短枝富士表現為著色異常、裂果癥狀，攜帶病毒為AgrCV、ASPV、ASGV。王林主要表現為畸形癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV。新世紀表現為裂果癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。

4.2新疆阿拉爾蘋果外觀異常在阿拉爾六團一連平均發病率為70.45%。對不同品種間發病率比較分析，王林的發病率為74.50%，短枝富士發病率為70.50%，新世紀的發病率為63.50%，同一地塊不同品種間的發病率無規律性。西一壟的發病率為83.20%，西二壟的發病率為78.20%，西三壟的發病率為73.20%，西四壟的發病率為47.20%，蘋果外觀異常發病率與不同地塊間無相關性。