真武湯調(diào)節(jié)腎間質(zhì)纖維化大鼠NF-κB表達(dá)的研究

宋立群，周波，贠捷，宋業(yè)旭，馬曉鵬，于思明，代麗娟，馬艷春

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱 150040；2.四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)）

·基礎(chǔ)研究·

真武湯調(diào)節(jié)腎間質(zhì)纖維化大鼠NF-κB表達(dá)的研究

宋立群1，周波2，贠捷3，宋業(yè)旭3，馬曉鵬1，于思明1，代麗娟1，馬艷春3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱 150040；2.四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)）

目的研究真武湯對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響，從分子水平對(duì)真武湯治療腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制進(jìn)行探索。方法采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法（UUO）制備大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，將150只SPF級(jí)健康雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尿毒清組以及真武湯低、中、高劑量組。術(shù)后2周、3周、4周分別處死大鼠，收集尿液、血清，結(jié)扎單側(cè)腎組織，對(duì)24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮含量進(jìn)行檢測(cè)，分別用免疫組織化學(xué)法、ELISA法檢測(cè)NF-κB的表達(dá)。結(jié)果在各時(shí)間點(diǎn)，真武湯各給藥組與模型組相比，大鼠梗阻側(cè)腎臟腫大和積水程度較輕，血肌酐、尿素氮含量較低，腎組織和血清中NF-κB蛋白表達(dá)均較弱。結(jié)論真武湯可減少間質(zhì)纖維化，減輕腎組織損傷，其延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

腎疾??；纖維化；NF-κB；大鼠，Wistar

腎間質(zhì)纖維化（RIF）和腎小球硬化是形成終末期腎病的重要原因之一，但其機(jī)制尚未完全闡明。故研究中藥防治RIF的作用機(jī)制，能為中醫(yī)藥治療終末期腎病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇150只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量180～200 g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 真武湯方，參考第5版《方劑學(xué)》教材，即炮附片、茯苓、白芍、生姜各9 g，白術(shù)6 g。將此劑量設(shè)為正常成人60 kg體質(zhì)量的1日劑量，根據(jù)成人每日用量42 g（1劑中藥），在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以正常人60 kg體質(zhì)量用藥劑量的10倍為低劑量，20倍為中劑量，40倍為高劑量，即分別為7 g·kg-1·d-1、14 g·kg-1·d-1、28 g·kg-1·d-1。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備真武湯湯劑。

尿毒清顆粒（廣州康臣藥業(yè)有限公司產(chǎn)）。根據(jù)文獻(xiàn)劑量，大鼠使用尿毒清的劑量為3.75 g·kg-1·d-1。

1.2 方法

1.2.1 分組 將150只大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組21只）和造模組，其中造模組大鼠又分為五組，模型組21只（B組），真武湯低27只（C組）、中27只（D組）、高劑量組27只（E組）和尿毒清顆粒對(duì)照組27只（F組）。采用UUO的方法復(fù)制大鼠RIF模型，假手術(shù)組僅切開腹腔并游離左側(cè)輸尿管，不做輸尿管結(jié)扎。

1.2.2 給藥方法 于術(shù)后第1天開始灌胃，用藥如下：A組、B組予蒸餾水；C組：予低劑量真武湯水煎液；D組：予中劑量真武湯水煎液；E組：予高劑量真武湯水煎液；F組：予0.15g／ml尿毒清藥液。每日1次。

1.2.3 標(biāo)本采集和檢測(cè) 分別在術(shù)后第2、3、4周前一天將大鼠放置代謝籠中收集尿液，檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量；取大鼠股動(dòng)脈血，分離血清用于檢測(cè)肌酐、尿素氮的含量，ELISA法測(cè)定NF-κB的表達(dá)；取結(jié)扎側(cè)腎組織，HE染色后于光鏡下觀察腎臟病理改變，免疫組織化學(xué)法來檢測(cè)腎組織中NF-κB的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析，多重?cái)?shù)據(jù)比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量的變化 見表1。

2.2 鼠血肌酐、尿素氮的變化 見表2，3。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白含量結(jié)果（±s，mg／24h）

表1 各組大鼠24 h尿蛋白含量結(jié)果（±s，mg／24h）

注：各組2周、3周、4周比較，P＞0.05

組別鼠數(shù)（只）2周3周4周假手術(shù)組6 15.76±1.40 16.13±1.59 15.65±1.35模型組6 15.89±1.47 15.78±1.56 16.17±1.57真武湯低劑量組8 16.02±1.52 15.96±1.49 16.05±1.59中劑量組8 15.97±1.48 16.10±1.53 16.06±1.55高劑量組8 16.07±1.56 15.83±1.42 15.96±1.47尿毒清組8 15.97±1.48 16.12±1.55 15.89±1.53

表2 真武湯對(duì)大鼠血清肌酐含量的影響（±s，μmol／L）

表2 真武湯對(duì)大鼠血清肌酐含量的影響（±s，μmol／L）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，dP＜0.01；尿毒清組與真武湯中劑量組比較，cP＞0.05

組別鼠數(shù)（只）2周3周4周假手術(shù)組6 36.52±5.37 36.78±6.54 36.45±5.86模型組6 98.61±10.07a81.53±8.02a87.36±8.97a真武湯低劑量組8 94.34±9.51 75.68±6.86b77.62±7.99b中劑量組8 84.49±7.98b62.84±6.01d65.29±6.15d高劑量組8 88.61±8.56b69.65±6.52b73.56±5.97b尿毒清組8 82.87±8.19bc63.52±5.96bc64.53±6.02dc

表3 真武湯對(duì)大鼠血清尿素氮含量的比較（±s，mmol／L）

表3 真武湯對(duì)大鼠血清尿素氮含量的比較（±s，mmol／L）

注：與假手術(shù)組比較，dP＜0.05，aP＜0.01；與模型組比較，eP＜0.01；與真武湯中劑量組比較，cP＞0.05

組別例數(shù)2周3周4周假手術(shù)組6 7.95±1.02 8.23±0.95 8.15±0.89模型組6 16.69±1.67a13.37±1.62d14.53±1.47a真武湯低劑量組8 15.52±1.51 12.65±1.42b14.23±1.63b中劑量組8 14.51±1.53b11.32±1.26e12.77±1.26b高劑量組8 14.13±1.67b12.28±1.34b13.15±1.58b尿毒清組8 14.37±1.55bc11.30±1.42bc11.85±1.35bc

2.3 腎臟組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響 見表4。

2.4 真武湯對(duì)血清中NF-κB蛋白表達(dá)的影響 見表5。

3 討論

活化的NF-κB可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄多種因子，包括細(xì)胞因子（如干擾素-β、腫瘤壞死因子-α、白介素等）、趨化因子（如單核細(xì)胞趨化因子-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α等）、黏附因子（如血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1等）、補(bǔ)體、免疫受體、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等［1-3］。因此，NF-κB參與感染、炎癥、免疫應(yīng)答、應(yīng)激、細(xì)胞的增殖和凋亡等病理過程，在很多疾病的發(fā)病機(jī)制中起到中心調(diào)節(jié)的作用［4］。在RIF過程中NF-κB主要作用包括：第一，參與調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致單核／巨噬細(xì)胞浸潤，腎組織炎癥并纖維化；第二，參與細(xì)胞產(chǎn)生各種致纖維化細(xì)胞因子；第三，促成纖維細(xì)胞增生、分化?？傊?，NF-κB是RIF各種通路的共同作用點(diǎn)，抑制其活性并抑制其調(diào)控其他因子的轉(zhuǎn)錄已成為抗腎纖維化治療的關(guān)鍵點(diǎn)。

表4 各組腎組織NF-κB免疫組織化學(xué)表達(dá)量比較（±s，平均光密度×10-2）

表4 各組腎組織NF-κB免疫組織化學(xué)表達(dá)量比較（±s，平均光密度×10-2）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，cP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，dP＜0.01；與真武湯中劑量組比較，eP＜0.05

組別視野數(shù)2周3周4周假手術(shù)組10 12.34±1.02 12.21±1.15 12.26±1.19模型組10 15.24±1.35a18.56±1.68c23.76±1.89c真武湯低劑量組10 13.92±1.11b17.25±1.72b19.47±1.83b中劑量組10 12.05±0.98b14.37±1.26d15.16±1.41d高劑量組10 13.64±1.02b16.48±1.53b18.51±1.80b尿毒清組10 12.73±1.14b14.65±1.32d16.86±1.47be

表5 各組大鼠血清中NF-κB蛋白表達(dá)的比較（±s，ng／m L）

表5 各組大鼠血清中NF-κB蛋白表達(dá)的比較（±s，ng／m L）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，dP＜0.01；與真武湯中劑量組比較，cP＞0.05

組別例數(shù)2周3周4周假手術(shù)組6 128.35±10.50 126.75±10.62 127.82±11.36模型組6 284.56±23.61a328.46±28.63a356.53±30.65a真武湯低劑量組8 268.66±25.43b296.72±25.83b319.71±30.69b中劑量組8 231.29±22.26b250.37±20.64d265.96±25.53d高劑量組8 259.67±23.46b278.51±22.35b286.65±25.76d尿毒清組8 239.52±19.64bc256.76±24.65bc268.49±23.92cd

真武湯一方出自漢·張仲景所著的《傷寒論》。《傷寒來蘇集》謂“真武，主北方水也?？矠樗?，而一陽居其中，柔中之剛，故名真武。是陽根予陰，靜為動(dòng)本之義”；《傷寒明理論》謂“真武，北方水神也，而屬腎，用以治水焉”。真武湯全方共五味藥物，辛溫壯腎之附子，溫燥健脾之白術(shù)、茯苓，辛散利水之生姜，合里益陰之芍藥，全方意在溫陽而化水。藥理研究證明，真武湯具有保護(hù)腎功能、強(qiáng)心利尿、改善血脂等作用。應(yīng)用真武湯治療腎小球腎炎、腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、糖尿病腎臟疾病等腎臟系統(tǒng)疾病均有報(bào)道［5］。

本實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠24 h尿蛋白定量比較無意義，這與其他實(shí)驗(yàn)報(bào)道結(jié)果一致，推測(cè)與UUO模型大鼠腎纖維化病變明顯，腎小球幾乎不受影響有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中模型組及給藥組大鼠肌酐、尿素氮含量在各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組，給藥組肌酐、尿素氮含量均低于模型組，其中真武湯中劑量組和尿毒清組最低，說明真武湯和尿毒清均有較明確的腎功能保護(hù)的作用。大鼠血清和腎組織中NF-κB蛋白含量結(jié)果顯示，真武湯各劑量組和尿毒清組與造模組比較均較低，說明真武湯和尿毒清組均可抑制大鼠血清和腎組織中NF-κB蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)說明真武湯能夠降低UUO模型大鼠血肌酐、尿素氮水平，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

［1］Sen R，Baltimore D.Inducibility of κ immunoglobulin enhancer-binding protein NF-κB by a posttranslational mechanism［J］.Cell，1986，47（6）：921-928.

［2］Henning B，Toborek M，Oshi Barve S，et al.Linoleic acid activates-nuclear transcription factor-kappa B（NF-kappa B）and induces NF-kappa B dependent transcription in culturedendothelial cells［J］.Am Clin Nutr，2000，63 （3）：322-328.

［3］Guijarro C，Egido.Transcription factor-kappa B（NF-kappa B）and renal disease［J］.Kidney Int，2001，59（2）：415-424.

［4］Dutta J，F(xiàn)an Y，Gupta N，et al.Current insights into the regulation of programmed cell death by NF-κB［J］.Oncogene，2006，25（51）：6800-6816.

［5］劉彩香，郭立中.真武湯在慢性腎臟病中的研究概況［J］.中醫(yī)研究，2008，21（4）∶61-64.

Effect of Zhenwu decoction on nuelear factor kappa B expression in renal tubu lointerstitial fibrosis in unilat-eral ureteralobstruction（UUO）rats

SONGLiqun*，ZHOU Bo，YUN Jie，SONGYeχu，MA Xiaopeng，YU Siming，DAI Lijuan，MA Yanchuan（*Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150040，China）

MA Yanchuan，Email：yanchunma＠163.com

ObjectiveTo investigate the effect of Zhenwu decoction on nuelear factor kappa B expression of renal tubulointerstitial fibrosis in unilateral ureteralobstruction（UUO）rats，and to explore the mechanism of the Zhenwu decoction for treating renal interstitial fibrosis.Methods The renal interstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction in rats was prepared.The 150 male wistar rats were randomly divided into six groups：sham operation group（n＝21），UUO group（n＝21），low-dosage of Zhenwu decoction group（n＝27），medium-dosage of Z henwu decoction group（n＝27），high-dosage of Zhenwu decoction group（n＝27）and Niaoduqing granules group（n＝27）.The rats were given daily by gavage starting one day after operation.A part of rats in each group were sacrificed respectively at 2th、3th、4th week after operation.The 24h urine and serum were collected，and the ligation of Unilateral kidney tissues was conducted.The level of 24 hour urinary protein，serum creatinine（Scr），blood urea nitrogen （BUN）were detected，and the expressions of NF-κB were observed by immunohistochemical method and ELISA.ResultsThe levels of serum Scr and BUN in Zhenwu decoction groups were lower than those in UUO group at each indicated time points.The expression of NF-κB in blood and renal were much lower than that in the Zhenwu decoction groups.Conclusion The Zhenwu decoction could delay the progression of renal interstitial fibrosis，which may be involved in the decrease of NF-κB expressions in UUO rats.

Kidney Diseases；Fibrosis；NF-kappa B；Rats，Wistar

R692

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.024

2013-09-15）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（12511519）

宋立群，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：qunli＠sina.com

馬艷春，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：yanchunma＠163.com