酶聯免疫吸附法檢測豬肉中喹諾酮類藥物步驟及注意事項

任艷娥

（朝陽縣畜產品安全監察所，遼寧 朝陽 122000）

喹諾酮類藥物常見的有洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑，是由人工合成的一類廣譜抗菌藥，對呼吸道疾病具有很好的治療效果，對厭氧菌、衣原體等也具有一定的作用，此類藥在2016年前被廣泛應用在畜禽、水產等養殖環節中，后經過相關專家的研究考評發現此類藥化學性質穩定，半衰期長，人類在食用了含有喹諾酮類藥物的動物相關產品后會在其體內蓄積，可引起耐藥性和潛在的致癌性，對人類身體健康產生一定危害，從而引起社會的廣泛關注。因此2016年1月1日國家已經明文規定在所有養殖環節中全面停用喹諾酮類藥物（洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑）。

2012年以來，酶聯免疫吸附法成為遼寧省各縣區實驗室快速篩查動物產品及組織中喹諾酮類藥物殘留的主要檢驗檢測技術手段，此方法快速便捷、靈敏度高、易操作、受環境因素影響相對較小、成本相對較低等特點，適合廣大基層實驗室大批量的篩查檢驗，因此受到縣一級檢測機構的青睞。酶聯免疫吸附法操作簡單其反應原理淺顯易懂，樣品中的喹諾酮類藥物和試劑盒酶標板上固定的抗原進行特異性競爭抗體，加入酶標記物，再加入底物，底物受到催化顯色，然后根據顯色的深淺萊判斷樣品中奎諾酮類藥物的含量，顯色越深含量越少，反之顯色越淺含量則越多。筆者從事化驗室殘留檢驗檢測多年，在實際操作中積累了一定的慚怍經驗，下面將以檢測豬肉中喹諾酮類藥物為例簡述檢驗檢測相關步驟及其注意事項。

1 樣品的前處理及注意事項

使用試劑盒前，仔細閱讀說明書(本文使用的是北京維德維康生物技術有限公司生產的喹諾酮類酶聯免疫試劑盒Ⅳ型96孔）。不要使用過了有效期的試劑盒，試劑盒應在冰箱冷藏環境中存放，不同批號試劑盒中的試劑不得混用，稀釋或摻雜使用會引起靈敏度、OD值變化，最后導致結果的不準確。試劑盒使用前，需將盒內各組分及待檢測的豬肉（肌肉部分）樣品置于實驗臺上恢復至室溫（25±2℃）（提示：約2小時），室溫如果低于25℃或試劑及樣本未回到室溫（20～25℃），會導致后面的OD值偏低，反之則偏高。應避免使用金屬類物質盛裝和攪拌試劑。各試劑在使用前請輕輕搖勻，混合時應避免出現氣泡。在酶標板空中依次加入標準品溶液、酶標記工作液、抗體工作液、AB混合液、終止液的各操作步驟不得超過3分鐘。在操作過程中，應盡量避免酶標板上方的空氣流動，尤其注意空調的風不能直吹。

檢測過程中所用的槍頭為一次性使用，不得重復利用。需按比例配比的工作液要求配比。

樣品的前處理：（1）在電子天平上準確稱取2±0.05克均質后的樣品于50毫升離心管中。（2）依次加入0.1毫升磷酸溶液（分析純2毫升濃磷酸加入98毫升去離子水混勻）、6毫升乙腈，立即充分渦動2分鐘。（3）離心機4000轉以上，至少離心5分鐘。（4）在離心后的離心管中取2毫升上清液于新的4毫升離心管中。（5）在通風櫥內，60～70℃水浴鍋中，針頭距離液面上方0.5～1厘米用氮氣吹干。（6）加入1毫升正己烷（在通風櫥內操作），充分渦動30秒，再加入0.5毫升樣品復溶液（1份濃縮樣品+3份去離子水制成），低速渦動30秒。（7）再到離心機上4000轉以上，離心5分鐘。（8）完全棄去上層正己烷及中間層雜質。（9）取50微升上清液，加入到450微升樣品復溶液中，充分渦動30秒。（10）取50微升進行檢測（注意：切勿吸到上層雜質）。

2 檢測步驟及注意事項

將板條插入酶標板架上，并記錄下所有標準品和樣品的位置，建議均做雙孔以上平行，未使用的板條用自封袋重新密封后，立即保存于冰箱冷藏2～8℃環境中記錄好日期；標準物質和無色的發色劑對光非常敏感，因此要避免直接暴露在光線下。用微量洗液槍吸取50微升各標準品工作液及樣品溶液分別加入到對應的標準品和樣品孔中。注意事項為，移液器吸取液體時應遵循快洗慢打的規則，建議采用吸二打一方式，可有效避免氣泡的產生，槍頭不要插到液面以下，也不要碰到孔壁，槍頭為一次性使用，不能重復利用。有條件的化驗室可使用多道移液槍在每孔中加入50微升酶標記物工作液，再在每孔中加入50微升抗體工作液。注意事項：標準品、酶標記物、抗體一定要按順序添加，槍頭也為一次性使用。蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10秒，注意此過程不要將板內液體震出板外，以免臨孔樣品被污染，充分混勻后，室溫下（25±2℃），避光反應40分鐘。輕輕揭開蓋板膜，尋迅速倒掉板孔中液體，在每孔加入260微升洗滌工作液（1份濃縮洗滌液+19份去離子水混勻制成），充分洗滌4次，每次浸泡15～30秒；有條件的機構建議購買自動洗板機，洗3次即可，省時省力，需注意的是，每次倒掉板內液體時動作需快速，迅速翻轉，同時注意臨孔避免樣品交叉污染，影響到檢測數據。倒掉板孔中液體后，將酶標板倒置于吸水紙上，拍干，如孔內有氣泡應用干凈的槍頭搓破，不同的孔需更換槍頭，然后立即在每孔中加入 100微升的A、B混合液。注意事項：底物A液、底物B液應按比例1∶1混合，必須充分混勻，混合液應在5分鐘內用完，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑，顯色液若有顏色變化表明變質，應當作廢。蓋好蓋板膜，用手輕輕振蕩酶標板10秒，充分混勻，室溫下（25±2℃），避光反應10～15分鐘；揭開蓋板膜后，在每孔中加入50微升終止液，輕輕振蕩酶標板10秒，充分混勻；注意反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚和衣服，如不小心噴濺到皮膚上應立即用清水沖洗干凈，嚴重者立即就醫。加完終止液后5分鐘內用酶標儀在雙波長450納米、630納米下讀取酶標板吸光度值，連接打印機打出檢測數據，當標準品吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質，此次操作失敗，同一樣品OD值相差不能超過0.2，反而該樣品得重新做。利用試劑盒專用分析軟件進行結果分析，操作簡便，結果計算更加準確，更適用于大批量樣本的快速檢測分析，計算過程中應注意往軟件輸入數據時認真填寫，保證數據的輸入的準確性并需由另一名檢測人員進行認真校對后出具檢測報告，確認無誤后簽字。整個操作過程需要檢測人員盡職盡責，每個環節緊密相連，嚴格按規程操作，是保證數據準確可靠的必要條件。