豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展

陳欣雅，申秋平，宋春雷，莊林林★

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400）

豬繁殖與呼吸綜合征 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸衰竭為主要特征的高致病性傳染病。目前，PRRSV 已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，給相關(guān)行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PRRSV 為單股正鏈RNA 病毒，屬動脈病毒科、動脈炎病毒屬。其基因組全長約15 kb。目前，研究發(fā)現(xiàn)該病毒存在7 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為N、M、GP2a、GP2b、GP3、GP4 和GP5。基因組學(xué)研究表明，PRRSV 可分為2 種基因型，即以VR-2332 株為代表的美洲型（NA-PRRSV）和以LV株為代表的歐洲型（EU-PRRSV）。我國主要的PRRSV 流行株為美洲型，但近幾年歐洲型也逐漸被發(fā)現(xiàn)。PRRSV 極其容易發(fā)生突變，目前已形成多種變異毒株循環(huán)流行的復(fù)雜態(tài)勢。我國主要使用高致病性毒株的弱毒疫苗來防控PRRSV，但該疫苗對當(dāng)前流行株保護(hù)力有限，導(dǎo)致疫苗株與流行株之間常發(fā)生重組，對PRRSV的準(zhǔn)確鑒定和科學(xué)防控帶來了極大挑戰(zhàn)。近年來，PRRS 疫情愈演愈烈，且有變異株毒力增強(qiáng)的趨勢。因此，臨床上迫切需要提高快速診斷PRRSV 的能力。

作為病原微生物精準(zhǔn)檢測的重要可選解決方案，分子生物學(xué)技術(shù)在動植物病原體快速檢測、食品安全、轉(zhuǎn)基因鑒別、環(huán)境監(jiān)測、遺傳性疾病篩查等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，應(yīng)用于PRRSV 快速檢測的分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、熒 光 定 量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增、依賴核酸序列擴(kuò)增、原位雜交、基因芯片、重組酶聚合酶擴(kuò)增以及測序技術(shù)等。本文就上述方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為豬繁殖與呼吸綜合征病毒精準(zhǔn)檢測及科學(xué)防控提供可選方法參考。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

1.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆 轉(zhuǎn) 錄PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR）是一種將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后再進(jìn)行核酸擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，主要用于RNA 病原體的快速擴(kuò)增及檢測。該技術(shù)可快速鑒別高致病性 PRRSV （High pathogenicity PRRSV，HP-PRRSV）與經(jīng)典PRRSV（Classical PRRSV，C-PRRSV）。Yang 等建立了一種一步法RT-PCR 方法。該方法可在癥狀出現(xiàn)前2 天檢測到病毒，并可在2 小時內(nèi)完成。且對于HPPRRSV 和C-PRRSV 的檢測靈敏度高，均可達(dá)25 copies/微升，為鑒別和預(yù)防PRRSV 感染提供了一種快速的核酸檢測方法。趙耘等基于LV、VR-2332 株ORF7 基因保守區(qū)域設(shè)計引物建立了一種套式RT-PCR 方法以準(zhǔn)確鑒定2 種亞群的PRRSV，且該方法的敏感性比RT-PCR 高10000 倍。Li 等 建 立 的RT-PCR 方 法 可 用 于PRRSV 感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和組織樣品，可以同時鑒別NA-PRRSV 的三種亞型并具有較高的特異性。顧海洋等根據(jù)HP-PRRSVNSP2 基因上87bp 連續(xù)缺失的特點，建立了一種RT-PCR的方法，可快速、準(zhǔn)確檢測出HP-PRRSV。

1.2 熒光定量PCR

1.2.1 染料法

實時熒光定量PCR （Real-time flurocentqualitative PCR，qPCR）的發(fā)展為病毒快速、精準(zhǔn)檢測提供了新的重要技術(shù)支持。熒光定量PCR可以實時對核酸進(jìn)行高靈敏度和特異性的定量。常用的熒光染料包括飽和熒光染料（如Eva Green、SolisGreen）和非飽和熒光染料（如SYBR Green I）。同時，染料法可通過溶解曲線來輔助分析PCR 產(chǎn)物。Martínez 等使用基于熔融曲線分析的反轉(zhuǎn)錄定量PCR 方法 （RT-qPCR）對PRRSV 進(jìn)行快速檢測和分型。結(jié)果表明，該方法可高效檢測PRRSV，并能準(zhǔn)確鑒別EU-PRRSV和NA-PRRSV。Zheng 等開發(fā)了一種基于SYBR Green I 的RT-qPCR 方法，可用于同時檢測和區(qū)分HP-PRRSV 和C-PRRSV。該方法可在一小時內(nèi)完成，且快速、靈敏、成本可控。單晶晶等以不同濃度的含有PRRSV-N 基因序列的質(zhì)粒為模板，測試SYBR Green I 法熒光定量PCR 的擴(kuò)增性能。結(jié)果表明，該qPCR 方法的擴(kuò)增效率為98.2%，且靈敏度比常規(guī)PCR 方法高5 倍，并具有良好的可重復(fù)性。Zheng 等利用SYBR Green建立了一種雙重實時熒光定量PCR 方法，可用于同時檢測PRRSV 和豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3）。該研究通過對采集的33 份具有呼吸和生殖衰竭癥狀的豬肺樣本進(jìn)行檢測，并與常規(guī)PCR 方法作對比。結(jié)果顯示，兩種方法檢出PRRSV 和PCV3 的陽性率一致，且熒光定量PCR 方法靈敏度優(yōu)于常規(guī)PCR。王榮等建立的基于SYBR Green I 染料法的RTqPCR 可以同時檢測96 份臨床樣品中的PRRSV并可在3 小時內(nèi)完成，具有簡單、方便、高效等優(yōu)勢。

1.2.2 探針法

基于探針的熒光定量PCR 方法具有特異性強(qiáng)的特點，且適用于多靶標(biāo)同時檢測。2018 年，于新友等根據(jù)豬瘟病毒 （Classical swine fever virus，CSFV）和PRRSV 基因組特異性保守區(qū)域建立了一種基于TaqMan 探針的RT-qPCR 方法。該方法檢測CSFV 和PRRSV 的靈敏度分別可達(dá)0.25 和1.99TCID50/100 微升。Xiao 等證明SYBR Green I 和TaqMan 探針的實時熒光定量PCR 方法都可用于檢測和區(qū)分HP-PRRSV 和C-PRRSV。同時對535 份樣品進(jìn)行了RT-qPCR和常規(guī)RT-PCR 檢測，結(jié)果表明，TaqMan 探針法的檢出率最高，適用于臨床樣品中PRRSV 的快速準(zhǔn)確檢測及鑒別。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000 年由Notomi 等學(xué)者發(fā)明的一種核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)。根據(jù)靶序列設(shè)計2 對擴(kuò)增引物（1 對外引物和1 對內(nèi)引物），利用高鏈置換活性的DNA 聚合酶 （Bst DNA polymerase）可在恒溫條件（61℃～65℃）下1 小時內(nèi)將靶序列數(shù)量擴(kuò)增至109～1010倍。Zhang 等建立了了一種逆轉(zhuǎn)錄LAMP （Reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法以對NA-PRRSV 進(jìn)行快速檢測。該方法可特異性識別NA-PRRSV，而與PCV 2、CSFV、豬 流 感 病 毒 （Swine influenza virus，SIV）和豬輪狀病毒等無交叉反應(yīng)性。使用該方法檢測臨床可疑樣品中的NA-PRRSV，陽性率約為79%（33/42），與使用豬肺泡巨噬細(xì)胞分離的結(jié)果一致。Guo 等使用生物素和熒光素異硫氰酸酯分別標(biāo)記環(huán)引物，開發(fā)出一種基于RT-LAMP 的核酸試紙條方法以即時檢測HPPRRSV。整個檢測過程可以在50 分鐘內(nèi)完成。通過檢測43 份臨床樣本并與RT-PCR 方法進(jìn)行比較，陽性率分別為32.56%和27.91%。結(jié)果證實，該技術(shù)可以用于HP-PRRSV 的快速檢測。此外，該方法可用于在疫情暴發(fā)的早期階段快速檢測HP-PRRSV，具有高度的精準(zhǔn)性。Chen 等針對PRRSV N 基因的6 個區(qū)域設(shè)計了4 條的特異性引物。恒溫反應(yīng)1 小時后，僅含有PRRSV的樣品可見典型的梯狀條帶，而其他病毒株無擴(kuò)增產(chǎn)物，表明所建立的RT-LAMP 方法適用于臨床樣品中PRRSV 的快速檢測。Li 等根據(jù)PRRSVORF6 基因建立了一種可快速檢測PRRSV 的RT-LAMP 方法，并通過瓊脂糖凝膠電泳及比色法來觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，RTLAMP 法可檢測出22 份不同來源的PRRSV 分離株，且與PCV2、SIV、CSFV 和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）無交叉反應(yīng)，敏感性為91.3%。該研究為PRRSV 的檢測提供了一種簡單且快速的檢測方法。

1.4 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)

依賴核酸序列的擴(kuò)增 （Nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）是一種靈敏高效的RNA 擴(kuò)增分子工具，目前廣泛應(yīng)用于臨床診斷。同時具有操作便捷、擴(kuò)增效率高、反應(yīng)時間短的優(yōu)點。NASBA 可在2 小時內(nèi)將RNA 模板擴(kuò)增109倍。NASBA 具有高效性，使反應(yīng)時間大大縮短，轉(zhuǎn)錄結(jié)果更準(zhǔn)確。并且該技術(shù)不易受到環(huán)境影響，適于現(xiàn)場即時檢測。梁海霞等基于NASBA 建立了一種可檢測HP-PRRSV 的酶聯(lián)免疫吸附方法（NASBA-ELISA）。結(jié)果表明，該方法可特異性檢測HP-PRRSV，而與C-PRRSV 及其他豬源病毒無交叉反應(yīng)性，適用于臨床樣品中HP-PRRSV 的高效檢測。

1.5 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)（In situ hybridization，ISH）用于識別基因的位置，定位和檢測細(xì)胞中特定的DNA 序列。該技術(shù)可在組織切片、單細(xì)胞或染色體中特異性識別DNA 或RNA。目前，原位雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛用于科學(xué)研究及臨床診斷。為深入探究PRRSV 在公豬體內(nèi)的持續(xù)存在機(jī)制，Shin 等通過使用地高辛標(biāo)記的RNA 探針進(jìn)行原位雜交（ISH）以研究PRRSV 感染的組織分布和部位，并將ISH 結(jié)果與反轉(zhuǎn)錄巢式聚合酶鏈反應(yīng)（RT-nested PCR）的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明PRRSV 在睪丸中的感染量可能較為有限，且不一定構(gòu)成精液中的主要病毒源。Larochelle 等比較了ISH 法和免疫組化法在檢測石蠟包埋組織中PRRSV 的效果。實驗感染豬組織和田間病例組織的檢測結(jié)果表明，ISH 技術(shù)比免疫組化法靈敏度更高，可為PRRS 的精準(zhǔn)檢測提供了一種快速、靈敏的方法。

1.6 基因芯片

基因芯片具有信息容量大、操作簡便、反應(yīng)迅速等特點，近年來已成為研究熱點。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的進(jìn)一步研究與發(fā)展，大量的基因芯片得到了發(fā)展和應(yīng)用。目前，基因芯片技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用于PRRSV 的快速檢測及鑒別分析，楊林等采用了不對稱PCR 方法獲得了熒光標(biāo)記單鏈雜交模板，從而建立了針對PRRSV 基因芯片檢測方法。通過對39 份樣品進(jìn)行檢測驗證，證明了該方法的可行性。郭煥成等根據(jù)PRRSV NSP2 基因缺失株與C-PRRSV 株的核苷酸序列設(shè)計寡核苷酸探針與基因缺失序列的探針，構(gòu)建了一種方便高效的基因芯片。經(jīng)實驗驗證，該芯片具有高度特異性，可以精準(zhǔn)鑒別臨床樣品中的HP-PRRSVNSP2 基因缺失株。

1.7 重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增 （Recombinase polymerase amplification，RPA）是一種近年來發(fā)展起來的新型等溫基因擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶可在37℃～42℃條件下實現(xiàn)對目標(biāo)基因進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。這種方法可實現(xiàn)快速、靈敏和多重分子檢測，并可用于現(xiàn)場即時診斷（Pointof-care testing，POCT）。Yang 等針對HP-PRRSV進(jìn)行快速檢測，開發(fā)了一種高效的實時RT-RPA檢測方法。敏感性分析表明，該方法的檢測限為70 拷貝/反應(yīng)。該RT-RPA 方法可特異性擴(kuò)增HP-PRRSV，與其他病毒（C-PRRSV、CSFV、PRV和FMDV）沒有交叉反應(yīng)性，適用于臨床樣品中HP-PRRSV 的精準(zhǔn)檢測。Wang 等開發(fā)了一種熒光RT-RPA 方法。反應(yīng)過程可在40°C 條件下20分鐘內(nèi)完成。RT-RPA 方法可以準(zhǔn)確檢測CPRRSV 和HP-PRRSV。該研究測試了60 份臨床樣品并與實時RT-PCR 進(jìn)行比較以評估其性能。結(jié)果表明，RT-RPA 的檢出率為86.6%（52/60），優(yōu)于實時RT-PCR（83.3%，50/60）。Liu 等聯(lián)合應(yīng)用RT-RPA、Cas12a 系統(tǒng)以及單鏈DNA 熒光淬滅（ssDNA-FQ）報告分子建立了一種高靈敏度的PRRSV 檢測方法。該方法可以在25 分鐘內(nèi)實現(xiàn)PRRSV 可視檢測，且檢測反應(yīng)可以在單管中完成。靈敏度可達(dá)單拷貝/反應(yīng)，與其他豬病毒無交叉反應(yīng)。經(jīng)RT-qPCR 和CRISPR/Cas12a 方法驗證，該方法檢測結(jié)果高度準(zhǔn)確。Tian 等結(jié)合RT-RPA 與側(cè)向?qū)游鲈嚰垼↙ateral flow dipstick，LFD）建立了一種檢測NA-PRRSV的方法（RT-RPA-LFD）。該方法對中國流行的NA-PRRSV 株具有高度特異性，且與PRV、PCV 2、CSFV 和PEDV 無交叉反應(yīng)性。臨床樣本驗證結(jié)果表明，該方法檢測結(jié)果與RT-qPCR 一致，具有臨床應(yīng)用價值。

1.8 測序技術(shù)

近年來，測序技術(shù)作為一種新的核酸診斷工具，為PCR 在臨床樣品診斷中的應(yīng)用提供極大的幫助，如菌株信息。目前，測序技術(shù)已成功地應(yīng)用于病毒學(xué)的各個領(lǐng)域，如病毒全基因組測序、新病毒的發(fā)現(xiàn)、鑒定和流行病學(xué)調(diào)查等。病毒基因組測序的應(yīng)用不僅為檢測PRRSV 提供了新的可選工具，同時也為研究人員更好地了解PRRSV 的流行病學(xué)以及病毒如何傳播和進(jìn)化提供了有力的技術(shù)支持。Tan 等利用RNA測 序 技 術(shù) （Oxford Nanopore MinION）檢 測PRRSV 毒株，準(zhǔn)確率高達(dá)99.9%，且成功鑒別了一份樣品中存在的多個共感染毒株。該技術(shù)最低可從含104個病毒拷貝的臨床樣本中獲得PRRSV 株系信息。Nan 等利用Illumina-MiSeq測序平臺，對感染PRRSV 的豬支氣管肺泡灌洗液、黏膜和盲腸中的微生物群進(jìn)行測序，以分析微生物群對豬繁殖與呼吸綜合征產(chǎn)生與擴(kuò)散的影響。通過微生物生態(tài)學(xué)的定量分析表明，PRRSV 感染豬肺部的優(yōu)勢菌群為副豬嗜血桿菌和豬支原體，相對豐度分別為35%～48%和27%～41%，實驗結(jié)果與臨床觀察一致，即PRRS 患病豬通常共感染其他細(xì)菌 （如嗜血桿菌和支原體）。測序技術(shù)為檢測與診斷PRRSV 提供了重要方法支持。

1.9 小結(jié)與展望

豬繁殖與呼吸綜合征嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。當(dāng)前，由于PRRSV 基因組的高突變率，給全世界范圍內(nèi)有效防控PRRSV 帶來極大挑戰(zhàn)。快速、準(zhǔn)確診斷對于豬繁殖與呼吸綜合征科學(xué)防控具有十分重要的意義。現(xiàn)有多種分子生物學(xué)方法可用于豬繁殖與呼吸綜合征的檢測，但這些方法各有優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)不同的實際檢測需要選擇合適的檢測技術(shù)。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展及交叉學(xué)科的融合，分子檢測方法必將得到優(yōu)化與發(fā)展，新型智能化及一體化設(shè)備也將不斷誕生，這些將為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的科學(xué)檢測提供新的有力技術(shù)與工具支撐。