塞內(nèi)卡病毒診斷技術(shù)研究進展

雷乾 ，劉娜，趙俊芳，孫鵬 ，盧曾軍，李志勇

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046；3.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035）

塞內(nèi)卡病毒A 型是導(dǎo)致豬傳染性豬塞內(nèi)卡病毒病的主要病原，該病毒于2015 年在不改變病毒名稱的情況下由國際病毒分類委員會（ICTV）允許將種名稱由“Seneca valley virus”改為“Seneca virus A”。SVA 病毒是2002 年首次在美國的一家公司進行腺病毒培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜母細胞上偶然發(fā)現(xiàn)的一種病毒，并猜想其可能來源于豬胰蛋白酶體或胎牛血清中，且在2005 年確定了第一個完整的基因組序列。塞內(nèi)卡病毒A（Seneca virus A，SVA）為單股、正鏈、無囊膜的小核糖核酸病毒科，是塞內(nèi)卡病毒屬唯一代表性的病毒株，最近研究發(fā)現(xiàn)該病毒是與心臟病毒屬成員密切相關(guān)的單鏈RNA 病毒，是一種能在人的癌細胞中復(fù)制的一種溶瘤性微小RNA 病毒，因此目前有研究將SVA 作為一種溶瘤病毒用于治療某些人類神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。

2002～2013 年期間，SVA 在美國和加拿大呈散狀發(fā)生；在2007 年的美國部分區(qū)域一些豬的口鼻和蹄冠部出現(xiàn)水泡、潰瘍等癥狀，經(jīng)過實驗室檢測判定為SVA 陽性，養(yǎng)殖行業(yè)的人們這才開始關(guān)注SVA 病毒帶來的危害；2014 年巴西有大量的SVA 病例發(fā)生，由該病毒引起新生仔豬死亡率在30%～70%，從那以后這種疾病在養(yǎng)豬業(yè)中逐漸受到重視；同年11 月，北美地區(qū)暴發(fā)SVA 疫情的數(shù)目逐漸增多，廣東省首次于2015年5 月出現(xiàn)SVA 引起的豬水皰病，并開始擴散，湖北省在2016 年開始涌現(xiàn)散發(fā)個案，2016 年12 月份黑龍江分離到塞內(nèi)卡毒株。截至2019 年12 月，在廣東、河南、湖北、黑龍江等地已經(jīng)報道了由SVA 引起的豬水泡病疫情，且SVA 毒株在不停的變異。SVA 臨床癥狀和口蹄疫病癥十分相似難以區(qū)分，對仔豬的危害性較大并給畜牧業(yè)帶來巨大的財產(chǎn)損失。本文對塞內(nèi)卡病毒臨床特征和檢測技術(shù)進行綜述，以期為SVA 病毒檢測防控提供技術(shù)參考。

1 臨床特征

SVA 感染豬后，育肥豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和公豬在鼻腔和口腔有潰瘍，鼻部和冠狀動脈束帶上有紅色聚集性侵蝕和破裂的小泡，偶見發(fā)燒跛行及腹瀉，仔豬在出生后的第一周表現(xiàn)出肌肉無力、嗜睡、流涎過多、皮膚充血、消瘦，神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和腹瀉等臨床癥狀；一些仔豬發(fā)生急性死亡。臨床癥狀持續(xù)3～10 天，然后在存活的仔豬中消失。

2 塞內(nèi)卡診斷技術(shù)

2.1 SVA 病毒的分離與鑒定

分離病毒時采集的樣品組織應(yīng)為病變明顯的部位，SVA 病毒應(yīng)采集食道和眼部的分泌物，頜下淋巴結(jié)，水泡液及水泡皮去進行體外的分離培養(yǎng)，用于SVA 培養(yǎng)的細胞系包括人胚胎視網(wǎng)膜細胞（PER-C6），豬睪丸細胞（ST）等，病毒誘導(dǎo)的細胞病變作用（CPE）可作為病毒感染的直接指標，而SVA 的CPE 需要較長的時間，并且必須具備相關(guān)的知識積累和實驗技能才能作出判斷，所以SVA 病毒在細胞上的分離鑒定來確診不是便捷有效的方法。

2.2 SVA 病毒的原位雜交和免疫組化

SVA 診斷可以通過原位雜交（ISH）和免疫組織化學(xué)（IHC）檢測組織中的抗原或核酸來實現(xiàn)，也可用于檢測組織樣本中的病原體可以顯示病原微生物在組織細胞內(nèi)的定位與分布。原位雜交技術(shù)最早由Pardue 和Gall、John 于1969年建立，它的原理是利用核酸的特性（即它們彼此特異性退火形成雜合體的能力）在細胞內(nèi)鑒定特定序列，將這些特定序列的DNA 或RNA 定位到特定細胞或染色體位點。Resende 等，在2017 開發(fā)了一種新的原位雜交技術(shù)——RNAscope （ISH）來檢測感染組織中的SVA 的RNA，通過靶向VP1 基因區(qū)域的特定RNA 探針來確認水皰病變中的病毒，并表現(xiàn)出高水平的特異性。這種新穎的原位雜交平臺將SVA 和組織學(xué)病變聯(lián)系起來，補充了qRT-PCR 作為一種診斷技術(shù)來研究潛在的新興病原體。Leme 等人對死后不久的仔豬進行常規(guī)尸檢，組織通過浸入10% 緩沖福爾馬林溶液中進行固定，并進行組織病理學(xué)評估，選擇來自口腔囊泡和皮膚損傷的組織切片用于免疫組織化學(xué)（IHC）測定，該測定采用單克隆抗體技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄PCR 測定出腹瀉仔豬小腸中的SVA，證明了SVA 在腸上皮細胞內(nèi)復(fù)制的能力。

原位雜交技術(shù)的缺點是難以識別具有低DNA 和RNA 拷貝的靶標，雖然免疫組織化學(xué)可以通過檢測與組織學(xué)病變相關(guān)的抗原來克服這一問題，但它需要特定的抗體，而這些抗體獲取需要一定難度并且特異性和敏感性較差。

2.3 分子生物學(xué)診斷

2.3.1 PCR

這項名為聚合酶鏈反應(yīng)即PCR 技術(shù)，能在短時間內(nèi)高效地擴增基因或特定核酸序列，廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤、法醫(yī)學(xué)、寄生蟲病、動物和考古學(xué)等領(lǐng)域的診斷和研究，PCR 法檢測SVA病毒也是一種實驗室常用的方法。Leme 等設(shè)計了一套引物以在RT-PCR 測定中擴增塞內(nèi)卡病毒基因組VP3/VP1 區(qū)域的542 bp 產(chǎn)物大小；范慧等在分析了SVA 的基因組后在5’UTR 和3D基因區(qū)域設(shè)計了三對PCR 引物并篩選出最合適引物對，通過優(yōu)化擴增體系和條件最終建立了RT-PCR 檢測方法。

2.3.2 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR 是在聚合酶鏈式反應(yīng)體系中加入熒光報告基團，在PCR 反應(yīng)的每個周期通過收集熒光信號的產(chǎn)生來進行監(jiān)測。因此，出色的靈敏度和特異性、可重復(fù)的數(shù)據(jù)、低污染風險和減少的手動操作時間（無需進行PCR 后分析）相結(jié)合，使實時熒光PCR 技術(shù)成為傳統(tǒng)PCR 的有力的替代品。林彥星等依據(jù)SVA 病毒上3D基因序列在軟件中設(shè)計最佳引物和探針，創(chuàng)建了檢測SVA 的實時熒光RT-PCR 法，該方法可檢測較低的敏感性；重復(fù)性好。陳鑫等根據(jù)對國內(nèi)18 株塞內(nèi)卡病毒的序列比對分析結(jié)果，在SVA的5’UTR 區(qū)域設(shè)計并合成一對特異性引物和Taqman 探針，采用Taqman 實時熒光定量PCR技術(shù)通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立定量檢測SVA 的方法。

2.3.3 數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是按照將含有核酸分子的反應(yīng)體系等分到大量獨立的反應(yīng)單元去進行擴增，目的核酸分子的絕對定量分析是根據(jù)陽性比例和泊松分布原理去計算的。數(shù)字PCR 消耗品成本較低，不存在已知濃度的參考物質(zhì)，與實時PCR 相比，在低濃度下目標定量的精確度以及對不同類型樣品的抑制劑的高抗性，ddPCR 在油相中產(chǎn)生液滴，可以避免液滴之間的非特異性擴增和交叉污染。除了用作診斷工具外，RT-ddPCR 還用于評估本項目的生物樣本，以便在不需要標準曲線的情況下提供SVA RNA 的絕對定量。Oliveira 等研究表明ddRTPCR 在測試豬血清時，其性能優(yōu)于RT-PCR，單步RT-ddPCR 和RT-qPCR。ddRT-PCR 用作SVA 的輔助診斷工具和生物樣品中病毒RNA的絕對定量，是水皰疾病控制計劃的有效工具。張洲等建立了一種檢測SVA 病毒3D 基因的逆轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字PCR （RT-ddPCR）的方法，該檢測方法的靈敏度比逆轉(zhuǎn)錄實時PCR 檢測方法高約10 倍，特異性實驗表明與其他豬水皰病病原體無任何交叉反應(yīng)。

2.3.4 巢式PCR

巢式PCR 是指先后利用2 套PCR 引物進行擴增的PCR 技術(shù)。Feronato 等設(shè)計了兩對引物對SVA 的VP1 基因組片段進行擴增。在對18頭的豬群進行RT-PCR 和巢式PCR 檢測時陽性率分別為11 頭（61.1%）和16 頭（88.9%）結(jié)果表明，與常規(guī)的RT-PCR 相比，巢式PCR 是巢式PCR 是一種靈敏、高效、簡單、經(jīng)濟的診斷方法；因此，巢式PCR 可以用作一種有效的診斷工具。

2.4 血清學(xué)檢測方法

2.4.1 病毒中和試驗

病毒中和試驗 （Virus Neutralization Assay）是一種血清學(xué)試驗，用于檢測阻止病毒傳染性的功能性全身抗體的存在和數(shù)量，是病毒學(xué)的經(jīng)典方法之一。VNT 檢測是一種高度敏感和特異的檢測方法，該方法是基于在血清中存在中和抗體的情況下抑制細胞培養(yǎng)中的病毒感染性。作為SVA 感染的診斷，常規(guī)VNT 的特異性和敏感性均略高于競爭性ELISA。劉福曉等使用反向遺傳學(xué)構(gòu)建了重組SVA CH-LX-01-2016，并被證明能夠在體外有效表達增強的綠色熒光蛋白（eGFP），這種熒光的跟蹤特性極大地促進了病毒中和試驗（VNT）的檢測效果。在此研究中，這種新方法比使用傳統(tǒng)方法更敏感和特異性，因為病毒中和實驗的最終結(jié)果將取決于綠色熒光蛋白，這種新型VNT 可廣泛用于臨床診斷。

2.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

通過使用酶標記的偶聯(lián)物和酶底物獲得的顏色變化來顯示抗原-抗體反應(yīng)并用于識別生物體液中分子的存在和濃度的定量分析方法通常被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），主要包括液相阻斷ELISA、固相競爭ELISA、間接ELISA等，可按照不同的檢測要求去進行選擇；孫培培等利用塞內(nèi)卡的重組VP2 蛋白及其相應(yīng)的辣根過氧化酶（HRP）標記的單克隆抗體，建立了檢測SVA 抗體的阻斷ELISA 方法；柴茂等建立基于VP2 蛋白、VP3 蛋白檢測豬塞內(nèi)卡病毒A 抗體間接ELISA 方法；Goolia 等開發(fā)了競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定（eELISA）作為SVA 抗體的篩選，這些試驗都可適用于檢測豬SVA 的臨床診斷。

3 其他新型檢測技術(shù)

3.1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

基于核酸的技術(shù)被認為是遺傳學(xué)診斷中最準確的工具。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)就是其中之一，近年來得到了廣泛的應(yīng)用。該方法的優(yōu)點在于快速、高效、靈敏、經(jīng)濟，它在等溫條件下工作，并使用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶擴增目標基因。迄今為止，該方法已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、作物生長發(fā)育和疾病診斷等不同研究領(lǐng)域。

田瑤等針對SVA 高度保守區(qū)域，設(shè)計了5對特異性LAMP 引物，并通過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗以及臨床樣本檢測，建立了一種新型塞內(nèi)卡病毒LAMP 可視化快速檢測方法，曾凡文等特異性擴增了SVA 的VP1 和VP2 區(qū)域用于開發(fā)實時RT-LAMP 的方法,該實驗證明實時RT-LAMP 比實時RT-PCR 的結(jié)果更優(yōu)越。

3.2 RPA

重組酶聚合酶擴增（RPA）是一種高靈敏度和選擇性的等溫擴增技術(shù)，在37℃～42℃條件下工作，樣品制備要求低，能夠在不到20 分鐘的時間內(nèi)擴增低至1～10 個DNA 靶標。它已被用于擴增來自各種生物體和樣品的各種靶標，包括RNA，miRNA，ssDNA 和dsDNA。此外，RPA 可以與不同的檢測策略結(jié)合，從側(cè)流層析試紙條到實時熒光檢測等。王慧寶等開發(fā)了一種簡單、快速和準確的診斷方法，結(jié)合重組酶聚合酶擴增和側(cè)向流動試紙條 （RPA-LF）來檢測SVA 感染，結(jié)果可直接在試紙條上觀察到。林彥星等建立了一種熒光RT- RPA 快速檢測法具有特異性強，簡便快速，重復(fù)性好，靈敏度高，比實時熒光RTPCR 法靈敏度低兩個數(shù)量級的特點。

4 討論與展望

SVA 的天然宿主是豬且與豬的水皰病緊密相關(guān)，對仔豬的危害較大給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，臨床上的病癥無法和口蹄疫區(qū)分開來，需要立即去進行排除診斷，中國的SVA 病例在多省份零星發(fā)生。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，SVA 的診斷技術(shù)已經(jīng)日益成熟，朝著更快速、準確、便捷的方面發(fā)展。目前已經(jīng)開發(fā)了各種診斷方法，從病毒分離實驗到競爭性和封閉抗原的ELISA 等常規(guī)方法到RT-PCR 和RT-LAMP 等基于分子的方法。盡管基于ELISA 的方法具有良好的診斷靈敏度和特異性，但分子檢測方法的優(yōu)勢在于檢測最小病毒RNA 具有更高的分析靈敏度。盡管有這些準確和可靠的SVA 檢測方法，研究人員一直在開發(fā)替代方法，以嘗試克服一些實際挑戰(zhàn)，例如繁瑣的程序和配備訓(xùn)練有素的現(xiàn)場人員的設(shè)備齊全的實驗室環(huán)境，開發(fā)了橫向流動裝置并將便攜式RT-PCR、RT-LAMP 和RT-RPA 與LF 技術(shù)相結(jié)合，以提高SVA 檢測的靈敏度。然而，這些檢測從實驗室到現(xiàn)場實際應(yīng)用的轉(zhuǎn)化仍然有限，需要解決各種技術(shù)和成本問題，以開發(fā)一種更靈活、更實惠的診斷工具，可廣泛用于SVA 檢測。