‘赤霞珠’種子成熟過程中縮合單寧的變化及其與顏色參數的相關性

劉敖一，夏弄玉，王京京，孫琪，潘秋紅

（中國農業大學食品科學與營養工程學院/農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

葡萄果實中重要的酚類物質有酚酸、黃酮醇、黃烷醇、花色苷和單寧，它們可以在葡萄酒釀造過程中浸出、轉化和衍生，從而決定了葡萄酒的顏色、口感、收斂性和陳釀潛力[1]。葡萄酒中酚類物質的種類和含量主要取決于果實，且與果實成熟度密切相關[2]，基于此，越來越多的葡萄酒生產者對葡萄果實成熟采收時期的判斷，除了考慮糖、酸含量之外，還特別關注酚類物質。

單寧是葡萄酒中一類非常重要的酚類物質，根據其結構和水解性質，可分為水解單寧（Hydrolyzed tannins）和縮合單寧（Condensed tannins）。水解單寧是由棓酸或棓酸衍生的酚羧酸與多元醇所組成的酯在酸、堿和酶的作用下產生的多元醇和酚羧酸，主要來源于橡木桶陳釀和外源性酚類，少量來源于葡萄的果皮和種子，對酸和熱的穩定性不及縮合單寧；縮合單寧又稱原花色素（Proanthocyanidins, PA），是由黃烷-3-醇單體聚合而成，葡萄酒中的PA主要來源于果皮和種子，葡萄種子的PA含量高于果皮，聚合度略低于果皮[3]。相對而言，葡萄果皮的PA容易浸出，在酒精發酵初期可大量浸提出來，而種子的PA浸出量較低，但在發酵后期或后浸漬階段，種子PA浸出速度加快，使得其在紅葡萄酒最終產品中的含量占比高于果皮PA[4]。葡萄果實不同來源的PA對葡萄酒滋味和口感有不同的影響，種子PA具有中等聚合度，總體上其澀感強度弱于果皮PA，優質葡萄酒的特點是種子單寧與果皮單寧的平衡[5]。在一些炎熱葡萄酒產區，由于果實成熟和種子成熟不同步，導致釀酒葡萄采收時種子未達到成熟狀態，從而對葡萄酒品質有較大影響[6]。因此，探究釀酒葡萄種子PA在果實發育過程的變化，找到快速判斷種子PA成熟的方法對葡萄酒釀造具有重要的意義。但是由于種子PA提取難度和分析方法的復雜性，目前關于它的研究相對較少。

PA可以與口腔中的蛋白質結合，從而在口腔中引起澀感。許多研究表明，澀感強弱與PA濃度和平均聚合度（mean degree of polymerization, mDP）呈現正相關[7-10]。PA的溶解度隨聚合度的增加而降低，利用其在丙酮水溶液中的溶解性，可分為可溶性PA和非可溶性PA[11]。通常認為，可溶性PA能夠在發酵過程中進入酒體，從而對葡萄酒口感產生影響，而較高聚合度的非可溶性PA在葡萄果實中與細胞壁成分結合，不容易浸到酒體中，即使浸至酒體也可能因分子太大而重新形成沉淀，對最終葡萄酒產品澀感的影響是有限的。以往對于PA聚合度，主要關注其mDP值，測定方法是采用強酸處理使PA水解為單體， PA中的延伸單元可以與親核試劑——間苯三酚結合，而末端單元不能與間苯三酚結合，從而實現對延伸單元和末端單元的分別計數，并計算mDP值[12]。從其測定原理可以看出，mDP值可以在一定程度上反映PA的聚合度大小，但不能反映PA的溶解性。因此，了解種子成熟過程中可溶性PA和非可溶性PA含量的變化，有助于預測其對葡萄酒感官質量的潛在影響，能夠為優質葡萄酒原料采收時期的確定提供參考。

葡萄種子中的單寧主要分布在表皮。已有研究表明，葡萄種皮顏色的變化與葡萄漿果花色苷和果皮總酚含量均顯著相關，這也說明種子的外觀和顏色可作為漿果整體成熟度的額外指標[13]。在葡萄種子發育過程中，種子表皮顏色由綠色到褐色的變化與種子中總PA含量下降時段一致，其中部分原因可能是由于單寧的氧化而導致種子顏色的加深[11]。通過探究種子表皮顏色的變化規律，建立表面顏色和種子PA含量之間的相關性，以期為實際生產中種子PA成熟度的快速判別提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用的釀酒葡萄品種為‘赤霞珠’（Vitis viniferaL. cv. Cabernet Sauvignon），以可溶性固形物為標準，2019年在物候期E-L33、E-L35、E-L35.5、E-L36、E-L37、E-L38六個點采樣，對應具體時間分別為轉色前15 d，轉色后0、6、15、46、67 d。采樣時設置3個生物學小區，每個小區15株，每次每個小區隨機選擇30穗果，兼顧陰陽面果穗，共采樣300粒，除了50粒用于測定糖、酸含量之外，其余的立即液氮速凍，低溫速運至實驗室，貯藏于﹣80℃超低溫冰箱中備用。果實破碎后取種子，測定表面顏色，之后種子磨粉，用于測定PA及其組成單元的含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄果實可溶性固形物和可滴定酸含量測定

取50粒果實，去除種子，將果實破碎、離心（4054 r·min-1，常溫）、取汁，采用數顯手持糖量計（PAL-1，Atago，Japan）測定葡萄汁的可溶性固形物含量，用百分數表示。參照GBT 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，測定可滴定酸含量，用酒石酸（g·L-1）表示。

1.2.2 種子可溶性和非可溶性PA的提取與測定

參照Yu等[14]進行，稍作修改。可溶性PA的提取與測定：取100 mg種子樣品粉末于2 mL離心管中，向樣品中加入1 mL單寧提取緩沖液（70%丙酮，0.1%乙酸，Vol），在冰水中超聲30 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清，沉淀按照上述步驟再提取兩次，合并3次得到的上清液，即為可溶性PA的粗提液。沉淀用于非可溶性PA的測定。

將上清液與等體積氯仿混合充分，4 ℃下以4054 r·min-1離心5 min，棄下層有機相，重復3次；在上層溶液中加入等體積正己烷，渦旋混合，4 ℃下以9730 r·min-1離心5 min，保留下層溶液，重復3次。對所得下層溶液氮吹，直至液面基本不變，液氮速凍，放于﹣20 ℃下冷凍干燥后，用600 μL 50%（Vol）色譜級甲醇/水溶液復溶，即得到可溶性PA提取液。每個樣品提取3份，分別用于以下測定。

取2 μL各樣品可溶性PA提取液以及各2 μL的0、0.75、1、1.5、3 mg·mL-1(-)-表兒茶素標準溶液于96板各孔中，隨后向各孔中加入100 μL 4-二甲基氨基肉桂醛（4-dimethyl-amino-cinnamaldehyde, DMACA）反應液（0.2% DMACA, w/v）溶于1∶1甲醇/3 N鹽酸。將96孔板放入Spectramax190酶標儀（美國Molecular Devices）中，室溫下輕輕震蕩5 min后，在640 nm下測量各孔的吸光值。種子可溶性PA的含量用(-)-表兒茶素濃度對吸光值制作的標準曲線進行定量，單位為mg·g-1。

非可溶性PA的提取與測定：將上述提取可溶性PA時得到的沉淀凍干，向干燥粉末中加入500 μL丁醇/濃鹽酸（95%丁醇，5%濃鹽酸，Vol）溶液，渦旋震蕩使沉淀重懸，置于冰水混合物超聲處理30 min，4 ℃下以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得到非可溶性PA提取液。

將非可溶性PA提取液以及終濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4 mg·mL-1PB1標準品的丁醇鹽酸溶液，分別加入到離心管中，共同在95 ℃下保溫1 h，冷卻到室溫后，用丁醇濃鹽酸將樣品稀釋5倍，取各樣品100 μL依次加入到96孔板中，測量各樣品550 nm的吸光值，各樣品中非可溶性PA的含量用PB1濃度對相應吸光值繪制的標準曲線進行定量，單位為mg·g-1。

1.2.3 葡萄種子PA結構單元含量測定及平均聚合度計算

（1）種子可溶性PA和非可溶性PA中黃烷-3-醇的提取。為測定可溶性PA提取液中的游離態黃烷-3-醇，將上述的可溶性PA提取液，經過0.22 μm濾膜過濾后，在﹣20 ℃下冷凍干燥，凍干的粉末用0.1 mL 50%（Vol）色譜級甲醇/水溶液復溶，可用于可溶性PA中游離黃烷-3-醇含量的測定。

為測定可溶性PA中聚合體的黃烷-3-醇單元含量，將上述可溶性PA提取液，經過0.22 μm濾膜過濾后，在﹣20 ℃下冷凍干成粉末，用0.2 mL間苯三酚裂解液（含0.5 g·mL-1抗壞血酸，0.3 mol·L-1鹽酸和50 g·L-1間苯三酚甲醇溶液）復溶；為測定非可溶性PA聚合體的黃烷-3-醇單元含量，則將上述提取得到的非可溶性PA粉末，直接用0.5 mL間苯三酚裂解液復溶。這些復溶液均在避光條件下，在50 ℃金屬浴中靜置20 min，這時非可溶性PA裂解為不帶間苯三酚基團的末端單元和帶間苯三酚基團的延伸單元。氮吹至干后，加入100 μL 50%（Vol）色譜級甲醇復溶，溶液用于非可溶性PA聚合體中各種黃烷-3-醇單元含量的測定。

（2）黃烷-3-醇的測定。利用實驗室建立的高效液相色譜與質譜聯用（HPLC-MS）分析方法[15]。儀器為 Agilent 1290 Infinity II UPLC與6460 triple quadrupole 質譜聯用儀，配備 XTerra C18色譜柱。HPLC 洗脫條件如下：A相（含0.1%甲酸的超純水溶液），B相（含0.1%甲酸的甲醇），流速 0.4 mL·min-1。洗脫程序：0～1 min，5%B；1～2 min，5%～10%B；2～17 min，10%～31%B；17～19 min，31%～95%B；19～20 min，95%～5%B；20～23 min，5%B。采用FIA（Flow Injection Analysis，每次進樣量為2 μL）方法配合MassOptimizer軟件（Agilent）對質譜檢測條件進行優化。質譜檢測器參數為：鞘氣流速12 L·min-1，溫度350 ℃；干燥氣流速5 L·min-1，溫度300 ℃；霧化氣壓30 psig；噴嘴電壓500 V；毛細管電壓2.5 kV；負離子掃描模式；碎裂電壓94 V；碰撞能量13 eV。

可檢測到的單體為兒茶素（(+)-Catechin，C），表兒茶素（(-)-Epicatechin，EC），表兒茶素沒食子酸酯（(-)-Epicatechin gallate，ECG）。其中游離單體從裂解前可溶性PA分離測出；延伸單元通過裂解后可溶與非可溶性PA的延伸單元單體與親核試劑加成，單獨測出計量；末端單元通過測定裂解后可溶性與非可溶性PA未與親核試劑加成的單體測出（可溶性PA中的末端單元還需減去游離單元含量）。根據保留時間和質譜信息（表1）進行定性，兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯的標準曲線進行定量，用mg·kg-1表示。

表1 各種黃烷-3-醇物質的保留時間和質譜信息Table1 Retention time and mass spectrum information of various flavan-3-ol compounds

（3）平均聚合度計算。平均聚合度（mDP）＝(水解后的延伸單元摩爾數＋水解后的游離單體摩爾數－水解前的游離單體摩爾數)/(水解后的游離單體摩爾數－水解前的游離單體摩爾數)[15]。

1.2.4 釀酒葡萄種子表面顏色測定

利用CM-3700A分光測色計（日本柯尼卡美能達公司）測得種子表面的明度L*值、色相a*值、色相b*值。通過下列公式計算得出色彩屬性指標飽和度C、色澤比H、色角度h以及色光值s，以量化種皮的顏色屬性，計算公式如下[16]：

其中，色澤比H為正數時代表紅色，為負數時代表綠色，數值越大顏色越深；色光值s綜合了色彩和明度；色角度h表示色彩的色相，色相環中0°代表紫紅色，90°代表黃色，180°代表綠色，當h＞100°時，隨h值增加綠色變深，h＜50°時，隨h值的增大紅色變淺；飽和度C代表色彩的鮮艷程度，也稱色彩純度，即樣品除去L*后的單純色相屬性，數值代表與L*垂直的距離，色彩純度隨距離增加而增大，也可以反映出不同顏色色彩的鮮艷程度。

1.3 數據統計分析

數據分析主要采用Eecel、SPSS 20軟件分析，黃烷-3-醇的定性定量分析主要采用Qualitative Analysis 10.0和QqQ定量分析軟件（Quant-My-Way），繪圖軟件為Origin 2018，色卡查詢及制作軟件為Adobe Photoshop 2019。

2 結果與分析

2.1 果實可溶性固形物和可滴定酸含量變化

由圖1可知，隨著果實成熟，可溶性固形物含量持續升高，而可滴定酸含量相應下降。在轉色后46 d，可溶性固形物達到了22.7%，可滴定酸含量為7.59 g·L-1，這時果實已經達到了采收標準。在轉色后67 d時，可溶性固形物增至25.25%，可滴定酸含量為6.54 g·L-1，這時的果實被認為處于過熟狀態。

圖1 ‘赤霞珠’果實可溶性固形物（A）和可滴定酸含量（B）變化Figure1 Variation of soluble solid content (A) and titratable acid content (B) in 'Cabernet Sauvignon'

2.2 種子可溶性PA和非可溶性PA含量的變化

從圖2可見，在葡萄果實發育過程中，可溶性PA含量呈現先上升后下降的趨勢，峰值出現在轉色啟動后6 d，含量達到66.35 mg·g-1；相反，非可溶性PA含量持續上升，在本研究最后一個采樣點（轉色后67 d）達到最大，為6.92 mg·g-1。非可溶性PA含量遠低于可溶性PA，但從其占總PA的比例看，隨著種子發育，非可溶性PA占比開始變化平穩，隨后逐漸增加。在轉色期（0 d）占比最低，這說明種子中非可溶性PA占比可隨轉色后果實成熟進程而增加。

圖2 果實發育過程中種子可溶性PA（A）、非可溶性PA（B）含量及非可溶性PA占比（C）的變化Figure 2 Variation patterns of soluble PA (A)，insoluble PA (B) content and the proportion of insoluble PA (C) in seeds

2.3 果實種子PA結構單元的變化

無論是游離的黃烷-3-醇還是種子PA的結構單元，葡萄種子中可檢測到的黃烷-3-醇主要有3種，分別是兒茶素（C）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG），在種子成熟過程中，它們的含量變化呈現不同的趨勢。

由圖3可知，發育早期的種子中，游離單體中含量最高的是ECG；隨著種子發育，游離的C、EC和ECG單體含量變化均為先增加后減小，暗示著隨種子成熟，越來越多的游離態黃烷-3-醇參與到PA的形成中。

圖3 葡萄種子發育過程中游離黃烷-3-醇單體的變化Figure 3 Variation of free-form flavan-3-ols during grape seed development

由表2可知，ECG是可溶性PA的主要末端單元，其在種子發育過程中含量變化不顯著，而末端單元C和EC的含量隨種子發育先增加后減小之后略微升高；EC是主要的延伸單元，但其含量在發育過程中變化也不顯著，C和EC的延伸單元則呈現先減少后期略有增加的趨勢。

表2 葡萄種子發育各個時期可溶性PA的末端單元和延伸單元的含量Table 2 Contents of terminal and extension unit of soluble PA in grape seed developmentmg·g-1

由表3可知，葡萄種子中非可溶性PA末端單元以ECG為主，而延伸單元以EC為主，并且EC在非可溶性PA結構單元組成中有非常高的占比。隨著種子的發育，末端單元的單體變化趨勢相似，總體都是先增加后減少，在轉色后15 d或46 d達到最大值；EC和ECG延伸單元都是先減少后增加，之后變化不顯著，而C總體呈現增加趨勢，這與非可溶性PA含量的增加是相符的。

表3 葡萄種子發育各個時期非可溶性PA的末端單元和延伸單元的含量Table 3 Contents of terminal and extension unit of insoluble PA in grape seed development mg·g-1

2.4 果實成熟過程中種子PA的mDP值變化

圖4 種子發育過程中可溶性及非可溶性PA的 mDP值變化Figure 4 Variation of mDP in soluble PA and insoluble PA during grape seed development

在種子發育過程中，可溶性PA的mDP值先呈下降趨勢，在轉色啟動開始達到最小為6.50，之后略有上升，變化不顯著；而非可溶性PA的mDP值變化趨勢與可溶性PA相似，但是達到最低的日期是在轉色后15 d，為11.74，之后隨著果實成熟，mDP值持續增加。在本研究的最后一個采樣點轉色后67 d，可溶性和非可溶性PA的mDP分別為7.45和16.87。

2.4 種子表皮顏色參數的變化

利用分光測色計測定不同發育時期葡萄種子表皮的顏色值L*、a*、b*，分析其表皮顏色參數的變化，并繪制色卡圖，結果如圖5所示，種子表皮由果實轉色前15 d的深綠色到轉色的淺綠色，轉色后6 d‘赤霞珠’種子表皮開始轉為淺棕色，接著為紅棕色，顏色不斷加深。

圖5 果實發育過程中種子外觀、表皮色卡及其L＊、a＊、b＊值的變化Figure 5 Variation of seed appearance, coat epidermal color and L*, a*and b* values during berry

L*表示種子色彩明度，隨顏色增亮而增大。在本研究中，種子表皮的L*值從果實轉色開始逐漸下降，說明種子表皮的顏色是不斷變暗加深的。a*為正值時，代表顏色偏向紅色，為負值則代表顏色偏向綠色。從圖5可見，在種子發育過程中，a*值由負變正，并逐漸升高，說明種子表皮的顏色是由綠色色調變為紅色色調，且紅色色調不斷增加；而b*為正值則代表顏色偏向黃色，為負值則代表顏色偏向藍色，該研究結果表明，b*值隨種子成熟其正值減少，表示黃色色調不斷減少。

2.5 種子表皮顏色與PA含量的相關性

對種子表面顏色相關參數及可溶性和非可溶性PA含量進行相關性分析，如表4所示。在葡萄種子發育過程中，可溶性PA和色角度呈極顯著正相關，與其它參數相關性不明顯。而非可溶性PA含量與L*值、b*值和飽和度呈極顯著負相關，與a*值、色澤比和色光值呈極顯著正相關，相似的相關關系也體現在非可溶性PA含量占比與各顏色參數之間、非可溶性PA占比與L*值、b*值和飽和度之間呈現顯著負相關，而與a*值、色澤比和色光值呈現顯著正相關性。在所有的表面顏色與PA含量之間的相關性中，非可溶性PA含量與色澤比的相關性系數最高，達到0.877。這些結果表明，在‘赤霞珠’種子的發育過程中，聚合度較大的非可溶性PA與種子表面顏色相關的L*、a*、b*、色澤比、色光值、色角度相關性都很強，可以用這些參數反映種子PA的含量狀況。

表4 果實發育過程中種子表面顏色參數與PA間的相關性Table 4 Correlation coefficients between the coat color parameters and PA in the seeds during berrydevelopment.

分別將種子可溶性和非可溶性PA含量、非可溶性PA含量占比作為因變量，L*、a*、b*、色澤比H、色光值s、色角度h、飽和度C作為自變量，進行多元線性回歸分析，結果如表5所示。

表5 不同發育時期‘赤霞珠’種子PA與表皮顏色的多元回歸方程Figure 5 The regression equation of PA and seeds coat color of 'Cabernet Sauvignon' in different developmental stages

PA含量與種子表面顏色參數擬合建立的多元回歸方程，相關系數（r）在0.935～0.947，表明擬合程度較好。其中非可溶性PA含量與表面顏色的回歸方程相關系數最大，達到0.947，表明該多元回歸方程可以充分反映不同發育時期‘赤霞珠’種子的PA含量。

3 討論與結論

單寧在決定葡萄酒收斂性、顏色穩定和陳釀潛力等方面起著重要作用。本研究表明，在‘赤霞珠’果實轉色之后種子中可溶性PA逐漸減少，而非可溶性PA相應增加，由于種子中可溶性PA含量顯著高于非可溶性PA，其結果就是隨種子成熟PA含量減少，這與前人研究結果相似。許多研究發現，葡萄成熟過程中，果皮單寧含量增加，種子單寧含量減少[17]，并且認為這與種子中單寧氧化并逐漸形成種衣有關[18-19]。

PA溶解度的差異也反映了其聚合度的高低，可溶性PA有相對較低的聚合度，而非可溶性PA有較高的聚合度，在種子發育過程中這些非可溶性PA會與細胞壁蛋白、多糖等細胞成分發生氧化交聯，造成溶解度降低[20]。在葡萄酒釀造過程中相對于非可溶性PA，可溶性PA的浸提率相對較高，因此，其對葡萄酒感官質量的影響相對較大。但另一方面，PA的收斂性強弱又與聚合度、分子結構密切相關，根據本研究結果，‘赤霞珠’種子中可溶性PA的mDP值在6.50～10.71，而非可溶性PA的mDP值在10.84～45.78。一般認為，只有聚合度＜20的PA可浸提至葡萄酒中[21]，低聚合度的PA會貢獻苦味，而高聚合度PA會貢獻澀味；隨著 PA聚合度增加，澀感的最大強度（maximun intensity, Imax）增加，同時苦味的Imax和總延續時長（total duration）下降[22]。因此認為隨種子成熟，高聚合度的PA增加而低聚合度的PA減少，有利于減輕所釀葡萄酒的苦味，在一定程度上增加澀感和豐滿度。

除了聚合度之外，PA組成單元的沒食子酯化率也與葡萄酒的澀感強度呈顯著的正相關[21]，具有較高的沒食子酯化率的單寧會有“令人不愉悅”的澀感，表現出干燥、粗糙以及顆粒感[23]。本研究表明，隨著種子成熟，游離的ECG顯著降低，且非可溶性PA中ECG呈現增加的趨勢，這暗示著種子的充分成熟，會使可浸出的ECG減少，間接地對所釀造的葡萄酒感官品質有正面作用。選擇合適的采收時間，可以為葡萄酒釀造提供優質的種子PA。

PA是植物色素成分，在擬南芥、小麥和油菜等植物的種皮以及棕色棉纖維中積累，氧化后形成棕色色素[24]。在葡萄種子中PA主要分布在表皮，在成熟過程中，種子的變色原因之一被認為是酚類物質的氧化。根據本研究的結果，種子表皮顏色相關的參數與種子PA的含量具有顯著的相關性，可以通過種子表面顏色的L*值、a*值、b*值、色澤比H、色光值s、色角度h和飽和度C做多元回歸線性方程，來反映出種子PA的含量。釀酒葡萄種子在采收過程中，可以利用L*、a*、b*顏色模型對種子PA的含量和成熟度進行快速判斷。本研究只初步證明種子表皮顏色與PA含量之間有相關性，但具體的合成機理仍然需要進一步確定。