三種羅漢松根際土壤微生物群落功能多樣性

霍燦燦 朱栗瓊 招禮軍 甘遠東 黃相玲

（廣西大學林學院/廣西森林生態與保育重點實驗室 廣西南寧 530004）

羅漢松[Podocarpus maerophyllus(Thunb.)]隸屬裸子植物亞門（Gymnospermae）松柏綱（Coniferopsida）羅漢松科（Podocarpaceae）羅漢松屬（Podocarpus），別名羅漢杉、羅漢柏，是國家二級保護植物[1]，主要分布于我國長江以南各省，因其樹形美觀，寓意“長壽”成為我國南方庭院觀賞、園林綠化優先考慮的樹種，我國約有 2屬14種。羅漢松在醫學上也有藥用價值，因其根皮果實均可入藥，可以治療多種疑難雜癥[2-3]。

植物根系土壤微生物量是植物根系微環境及根系生長發育良好的重要表征，對于根系發達的喬木或灌木，根系土層深度的差異會在土壤微生物的數量、組成及功能上體現。羅漢松是古老的裸子植物，為喬木或灌木，根系發達，在自然界中羅漢松屬植物普遍具有共生結瘤的現象，同時存在共生菌，如細菌、放線菌、真菌等，根系微生物豐富多樣。根瘤內生固氮菌具有一定的固氮酶活性，其生物固氮體系與豆科植物具有高度的相似性[4]，羅漢松根系菌根及根系結瘤內生菌的特性隨著土層深度的變化而變化。主要體現在不同的土層深度，羅漢松根際土壤微環境、根系結瘤量、生物固氮能力具有不同程度的差異。土層深度及根系特征與根際微生物群落的功能和代謝的相關性研究主要集中在農作物連作方面，而有關羅漢松科植物方面的研究報道鮮見。如有研究表明，0～20 cm土層內紫花苜蓿田間土壤細菌和放線菌數量高于20～40 cm土層，而真菌數量變化不大[5-8]。因此，本研究采用Biolog微平板法，以3 種羅漢松的 0～10、10～20、20～30 cm 三個不同土層深度為研究對象，從根際微生物群落碳源利用的角度，研究不同土層深度羅漢松根際土壤微生物群落功能多樣性，以了解羅漢松根際土壤微生物功能的變化，分析羅漢松復雜的共生體與土壤環境的相關性，為羅漢松的撫育管理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 以采自中國廣西南寧市隆安縣金穗園林花木場3種羅漢松，即臺灣大葉羅漢松（Podocarpus nakaii）、金鉆羅漢松（P. annamiensis）、羅漢松（Podocarpus macrophyllus），（以下分別用A、B、C 表示），根際的 0～10、10～20、20～30 cm三個不同土層深度的土壤為試驗材料。

1.1.2 樣地概況 金惠園林花木場，位于中國廣西的西南部，地處東經 107°40'～108°11′，北緯22°18′～23°14′，屬南亞熱帶濕潤季風氣候，炎熱多雨，冬短夏長。年平均降雨量1 301 mm，年內降雨量分配不均勻，季節性較強，降雨多集中在夏季。年平均氣溫 21.8℃，年最高平均氣溫月 7月28.4℃，最低平均氣溫月1月13.2℃。采集樣地土壤，測得土壤 pH 5.8～7.6，有機質為12.37～17.32 g/kg，全氮含量為 1.02～1.66 g/kg，全磷含量為 0.42～2.94 g/kg，全鉀含量為 3.69～5.54 mg/kg。（因樣地不同樹種間種植距離較近，土壤條件基本一致，且測量的樣地中不同品種不同土層土壤理化性質未顯現出一定的規律性，故未分析土壤微生物多樣性與土壤理化性質之間的關系）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2017年10月上旬，選擇晴朗的天氣在金穗園林花木場金鉆羅漢松（A）、臺灣大葉羅漢松（B）、羅漢松（C）基地分別采樣。植株的選擇采用傳統的“5點法”。將植物地表0～2 cm 土壤去除，再用鐵鏟分別挖至距離地表0～10 cm（標記 1）、10～20 cm（標記 2）、20～30 cm（標記 3）處，將根暴露出來，輕輕抖掉根系外圍土壤后，用軟毛刷將粘附在根系上的土壤輕輕刷下來，作為根際土壤。用無菌封口袋將各土層深度根際土壤裝好并做好標識，放入冰盒帶回實驗室研磨過2 mm篩后置于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 土壤微生物功能多樣性的研究 羅漢松根際土壤微生物功能多樣性的研究分析參照Classen等[9]方法。將土樣從冰箱中取出，放在25℃條件下活化24 h，取10 g土樣于250 mL三角瓶中，加入90 mL經滅菌的NaCl溶液（濃度為0.85%），將三角瓶置于旋禍振蕩器上以 200 r/min震蕩30 min，靜置后取一定量上清液并采用無菌NaCl溶液稀釋至 1 000倍，制備出接種液并移至儲液槽。使用 8孔道排槍向 ECO板培養基孔中加150 μL接種液，每個樣品3次重復；將接種好的微孔板放入25℃恒溫培養箱中；分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h使用Biolog微生物自動鑒定系統測定吸光度，測定波長分別為590（顏色+濁度）和750 nm（濁度）。

1.2.3 數據分析 采用Excel 2010和SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。采用主成分（PCA）法分析羅漢松根際土壤微生物對碳源利用情況。繪圖在Excel 2010中完成。

羅漢松根際土壤微生物代謝強度用AWCD描述，表征微生物利用單一碳源的能力[10]。計算公式為：AWCD=[(Ci-R)]/31。式中Ci為i個非對照孔測出的吸光度值，R為對照孔的吸光度值，若Ci-R為負數則可記為0。

用 Shannon多樣性指數、Simpson優勢度指數及McIntosh均勻度指數（U）表示羅漢松根際土壤微生物代謝功能多樣性。其計算方法如下：

式中，ni為第i個孔測出的吸光度值，Pi為ni與整個平板相對吸光值總和的比值。

2 結果與分析

2.1 羅漢松根際土壤微生物利用全部碳源動力學分析

由圖1可知，羅漢松根際土壤微生物隨著培養時間的延長對碳源的利用強度呈逐漸遞增的趨勢。不同種羅漢松根際土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）存在差異（表 1）。在培養時間96 h后增長幅度逐漸減小并趨于穩定不變的趨勢，在培養初期（24 h）羅漢松根際土壤微生物AWCD值較小，表明在培養初期土壤微生物對碳源的利用程度較低，但隨著培養時間的延長，土壤微生物逐漸適應Biolog板孔中的微環境，迅速進入快速增長期，AWCD值也迅速增大。在 96 h后AWCD值增長逐漸平緩直到培養末期Biolog平板中碳源逐漸被消耗減少，土壤微生物進入增長衰退期，AWCD值也逐漸趨于穩定。同種不同土層深度土壤微生物AWCD值為 10～20 cm＞0～10 cm＞20～30 cm；同土層深度不同種間土壤微生物AWCD值為羅漢松＞臺灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松。

圖1 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD隨著培養時間的變化

表1 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD隨著培養時間變化顯著差異情況

2.2 羅漢松根際土壤微生物群落多樣性指數分析

羅漢松根際土壤微生物經過96 h的培養后，在不同土層和不同種間AWCD值及生物多樣性指數表現出不同的差異。由表2可見，AWCD值在3種羅漢松種間變化規律為：羅漢松＞臺灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松，同種不同土層深度下AWCD值差異明顯。10～20 cm土層深度AWCD值最大，金鉆羅漢松為1.257，臺灣大葉羅漢松為1.557，羅漢松為1.820。Shannon多樣性指數在同種不同土層深度下差異明顯，10～20 cm土層深度Shannon多樣性指數明顯高于0～10、20～30 cm土層。金鉆羅漢松與臺灣大葉羅漢松Simpson優勢度指數在同種不同土層深度變化幅度較小，其值在 0.94～0.95變化且差異不顯著。金鉆羅漢松與羅漢松McIntosh指數總體要低于臺灣大葉羅漢松。

表2 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD和多樣性指數

2.3 羅漢松根際土壤微生物利用碳源類型分析

Biolog微平板上共有31種碳源，可將其分為六大類，即氨/胺類、羧酸、聚合物、氨基酸、糖類、其他化合物，土壤微生物在培養生長的過程中對各種碳源的利用強度也存在差異。如圖2所示，羧酸、糖類、氨基酸是羅漢松根際土壤微生物主要的利用碳源。同種不同土層深度下，0～10 cm土層深度羅漢松根際土壤微生物對 6種碳源的利用強度明顯高于其他土層深度的微生物。隨土層深度的加深，羅漢松根際土壤微生物對這，6種碳源的利用強度逐漸降低。不同種同一土層深度下，對6種碳源的利用強度為：羅漢松＞金鉆羅漢松＞臺灣大葉羅漢松。3種羅漢松根際土壤微生物對氨/胺類、聚合物、其他化合物這3種碳源的利用強度明顯低于羧酸、糖類、氨基酸這3種碳源。在氨/胺類碳源中，羅漢松0～10 cm土層根際土壤微生物利用強度最大，相比于金鉆羅漢松 0～10 cm 根際土壤微生物利用強度高出19.0%，比臺灣大葉羅漢松0～10 cm根際土壤微生物高出38.89%，3種羅漢松對聚合物碳源的平均利用強度最大是羅漢松，為 2.97，比臺灣大葉羅漢松高出18.8%，比金鉆羅漢松高出6.1%。

圖2 羅漢松根際土壤微生物對6種碳源的利用分析

2.4 羅漢松根際土壤微生物對碳源利用的主成分分析

對 3種羅漢松在不同土層深度下根際土壤微生物對單一碳源的利用進行主成分分析。如表 3所示，從31種碳源中提取3個主成分因子分別能夠解釋變量方差的 27.8%、25.9%、18.4%，主成分1和2的累積貢獻率可以達到53.7%。表明羅漢松根際土壤微生物對碳源利用強度的變異來源主要是主成分1和2，因此大部分信息都可以用這2個主成分來解釋。不同土層深度不同種間，羅漢松根際土壤微生物利用碳源強度存在明顯差異。

表3 主成分的貢獻率和累積貢獻率 單位：%

如圖3所示，在PC1軸上金鉆羅漢0～10 cm土層、臺灣大葉羅漢松 0～10、10～20及 20～30 cm土層均分布在負方向，得分系數為-0.169 ～ -0.002，說明這4個土層深度下羅漢松根際土壤微生物對單一碳源利用與主成分1相關系數為負，呈負相關。在PC2軸上除了羅漢松20～30 cm土層分布在負方向，得分系數為-0.106，其余種不同土層均分布正方向，說明羅漢松根際土壤微生物對單一碳源的利用基本與主成分2相關系數為正，呈正相關。在PC1軸上金鉆羅漢松A1土層與臺灣大葉羅漢松B1、B2、B3各土層主成分的分析均無明顯差異，表明金鉆羅漢松 A1土層與臺灣大葉羅漢松在主成分1中對碳源的利用具有相似性，金鉆羅漢松 A2、A3土層、羅漢松 C1、C2土層相互之間主成分得分系數均無明顯差異，說明在0～20 cm 土層內金鉆羅漢松與羅漢松具有相似的方式利用碳源。在 PC1、PC2軸上，羅漢松 C3土層與各土層之間及其它種不同土層深度下主成分得分均差異明顯，表明羅漢松20～30 cm土層對碳源的利用與其他品種各土層根際土壤微生物對碳源的利用模式存在較大差異。

圖3 羅漢松根際土壤微生物利用碳源的主成分分析

對31種碳源與主成分1、主成分2的相關性進行分析可知（表4），與主成分1顯著相關的糖類碳源有5種，氨基酸類碳源有3種，羧酸類碳源有2種，聚合物類碳源1種，共11種碳源與主成分1有顯著的相關性。與主成分2顯著相關的碳源共15種，其中糖類碳源有2種，氨基酸類碳源有3種，羧酸類碳源7種，氨/胺類碳源有2種，其他類碳源1種。綜合分析可知，羅漢松根際土壤微生物對碳源的利用主要是糖類、羧酸類、氨基酸、胺類四大類碳源，說明糖類、氨基酸、羧酸、胺類在主成分分析中起主導貢獻。

表4 三十一種碳源與主成分1、2的相關系數

3 討論

土壤是微生物天然的生活場所。一方面，土壤中水分、礦物質、有機質為微生物提供了必要的生存條件；另一方面土壤微生物群落結構及功能多樣性能夠直接反映土壤生態系統的健康狀況[11-12]。土壤微生物在土壤生態系統中扮演著重要的角色，影響著農林牧業的發展。有研究表明，微生物在土壤中通過一系列的“搬運”及轉化，為作物提供養分，如大豆作物中的根瘤固氮菌通過一系列的氨化、硝化作用將空氣中的氮氣及土壤中的有機質轉化為作物可利用的氮和養分[13-14]。微生物在土壤中的分布及功能是土壤環境與微生物自身共同決定的，而植物可以通過改變土壤微生物群落的結構來改變土壤環境。一方面，植物根系分泌物可以影響微生物的生長類型及分布，不同根系分泌物的含量及成分會不同程度地改變根際土壤微生物的代謝；另一方面，植物根系結構及在土壤層中的分布也會影響土壤微生物的群落結構及功能多樣性。研究表明，在10～20 cm的土層深度下紫花蓿苜土壤中的細菌要高于 20～30 cm的土層，而真菌數量低于20～30 cm土層[6]。

Biolog微平板法是一種現代研究土壤微生物功能多樣性的較新方法，原理是微生物利用碳源而發生氧化還原反應，其顯色深淺可以表征微生物對碳源的利用程度，來間接反映土壤微生物的種類多樣性[15-16]。本研究發現，3種羅漢松不同土層深度根際土壤微生物的生長模式基本一致，都要經歷適應期、對數期、穩定期；但隨時間的推移，各土層根際土壤微生物AWCD增長幅度變化存在差異，微生物在各生長階段AWCD值也不同，表明微生物對碳源的利用強度也不同。研究表明，AWCD值變化幅度越大，對碳源的利用強度越大，土壤中微生物越豐富[16]。本試驗中在同種下10～20 cm土層AWCD值最大，各土層微生物均在培養96 h后開始進入對數增長期，這說明3種羅漢松在10～20 cm土層微生物最豐富，對碳源的利用強度最大，在這一土層深度中微生物相對較活躍參與土壤養分的轉化供植物生長，各土層微生物有一個基本相同的適應期。經觀測分析發現，在同一土層深度不同種間，其AWCD值也存在差異，在各培養時間段其變化幅度也存在較大的差異，表明不同種羅漢松根系特征對土壤微生物群落結構也會產生影響。也有研究發現，羅漢松根系具有與豆科植物相似的性狀特性，其根系結瘤呈橢圓形狀似米粒大小[17-19]。本研究中3種羅漢松的AWCD值為羅漢松＞臺灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松，表明在同一生長環境下，羅漢松的根際土壤微生物更豐富，對碳源的利用強度更強。

為進一步研究羅漢松根際不同土層土壤微生物功能多樣性的規律，用Shannon多樣性指數、Simpson優勢度指數以及McIntosh均勻度指數來衡量[20-22]。研究表明，植物根冠區有利于維持其生命力，并且植物殘根可增加土壤肥力[23-25]。本研究中，在相同種下10～20 cm土層Shannon多樣性指數、McIntosh均勻度指數均明顯高于其他土層，羅漢松主根發達能夠深入土壤，使土壤具有較強的水土保持能力；而根冠區在土壤中穿越，既疏松了土壤又使自身根冠區細胞不斷更新保持活力不會腐朽；在10～20 cm土層，主要是羅漢松的側根及細根的分布層，根系遺留下的殘根及地面上的枯枝落葉經過腐化后形成腐殖質，使土壤的孔隙度、通透性、保水能力增大，良好的土壤環境為微生物提供了一個優良的生存場所。

綜上所述，根際土壤層深度、羅漢松種類對羅漢松根際土壤微生物群落結構及功能多樣性的影響均有差異。在相同品種下同一環境中10～20 cm土層深度微生物群落多樣性明顯高于 0～10、20～30 cm土層，說明10～20 cm土層是根際土壤微生物優良的天然生活場所，是微生物對植物發揮根際效應及土壤養分轉化的良好空間。在相同土層深度下不同種間，羅漢根松際土壤微生物群落多樣性明顯高于其他2個品種。因此，在土壤健康狀況的保護中，在羅漢松引種種植上可以優先考慮對土壤微生物群落影響較小、微生物功能多樣較高的羅漢松。