高原耐鎘真菌的分離鑒定及吸附性質研究

譚宇軒，李轅成，3*，張哲昊，毛林利，楊 浪

（1.大理大學 農學與生物科學學院，云南 大理；2.云南省高校微生物生態修復技術重點實驗室，云南 大理；3.昆明理工大學 冶金與能源工程學院，云南 昆明）

前言

隨著科技的不斷進步及工農業和城市化進程逐步加快，人類對水資源的利用需求日益增加，污水排放量也隨之增加[1]，其中重金屬污染是水體污染的主要因素之一。當前，我國正面臨著重金屬污染問題[2]，重金屬的污染治理對人類生產生活和生物多樣性保護都至關重要。

然而，目前人們對排放污水的處理效率依然不高[3]，未經過處理或未達到規定處理標準的污水進入河流或地下導致水資源破壞加重。當前，對水體重金屬污染的處理常采用化學沉淀法、離子交換法、光催化法、膜分離法、絮凝與混凝法及吸附法[4]。吸附法因其吸附材料來源廣泛且操作簡單、具有較高的重金屬結合能力和較為寬泛的pH 范圍、對環境無二次污染以及成本低廉等優點被人們在工業中廣泛使用。其中生物吸附法具有去除率高、處理成本低、生物吸附材料來源廣泛、吸附劑容易再生和無二次污染等優點，因此在重金屬處理方面受到廣泛的關注[5]。微生物吸附法是通過某些微生物體本身及其胞外分泌物對吸附溶液中的金屬離子的方法，其操作相對簡單、處理成本較低、對環境友好，在處理濃度較低且含多種重金屬廢水時具有良好的應用前景[6]。因此，篩選具有重金屬吸附能力的微生物很重要。

鎘（Cd）是重金屬中毒性最強的金屬元素之一，工業生產過程中產生的含鎘廢水、廢氣和廢渣、含鎘農藥的廣泛運用都可能造成水體及土壤重金屬污染[7]。鎘對微生物的生長繁殖具有很強的抑制性，因此高耐鎘的微生物的篩選及其吸附效果的研究相對較少。真菌相比細菌和放線菌具有更高的重金屬耐受性，通過其茂密的菌絲細胞壁上的大量幾丁質、蛋白質、葡聚糖、甘露聚糖、脂類、多糖、色素等來吸附水溶液中的重金屬[8]，因此真菌也更具有重金屬吸附菌株開發潛力。本文通過篩選及馴化蒼山的土著菌株對水體重金屬鎘的吸附開展研究，具有重金屬鎘污染環境的生物修復提供參考價值。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

1.1.1 實驗土壤來源

研究地點位于大理蒼山世界地質公園周邊，海拔高度為2 286 m，地理位置北緯25°40 ′7″，東經100°9′10″；在2021 年9 月份，使用土壤采集器采集距地表7～10 cm 的土壤作為樣品，保存至4 ℃冰箱中。

1.1.2 實驗試劑

鹽酸；氫氧化鈉；瓊脂粉；葡萄糖；無水乙醇；水合氯化鎘，鎘元素標準溶液；砷元素標準溶液；TreliefTMPlant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒。

1.1.3 實驗儀器

電感耦合等離子質譜儀（ICP）；智能型光照培養箱；恒溫震蕩器；高速冷凍離心機；紫外潔凈工作臺；電子天平；循環水真空泵；超純水機；自動高壓蒸汽滅菌鍋；冷凍干燥機；微分干涉顯微鏡；數顯恒溫水浴鍋；超低溫冷凍儲存箱。

1.1.4 培養基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉7 g，121 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖水培養基（Potato Dextrose Broth，PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

注：配置含重金屬培養基時，稱取適量水合氯化鎘固體粉末，在500 mL 容量瓶中溶解并定容后加入液體PDA 培養基中并于115 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐鎘真菌的土壤采集

實驗選取大理蒼山地質公園周邊土壤，選取4 個樣方（0.5 m×0.5 m），樣方與樣方之間相隔10 m 以上；將土壤表層雜物和浮土去掉后，利用五點采樣法采集距地表7～10 cm 的土壤，采集后土壤混合均勻后用聚乙烯采樣袋收集并封口，保存于5 ℃的冰箱備用。

1.2.2 耐鎘真菌的篩選

稱取5 g 采集的土壤，與100 mL 無菌水充分混合后靜置1 h，用滅菌后的移液管吸取1mL 上清液加入到含鎘15 mg/L 的PDA 固體培養基中涂布，在27℃的培養箱培養4～5 d，將其中生長狀況好的單菌落逐步接種至更高濃度的平板中繼續馴化，最后將得到的單菌落轉接3 次以上進行菌種純化，并保存于4 ℃的冰箱中。

利用平板劃線法篩選出一批生長良好且耐低濃度重金屬鎘的微生物菌株，平板劃線純化后從中優選出一株編號為H1 的真菌。通過水壓片觀察其菌絲形態，參照《真菌鑒定手冊》（菌種初步鑒定依據的參考書）對H1 菌株進行形態學初步鑒定。將純化后的菌株接種到PDA 固體培養基上，27 ℃培養箱培養7 d后，并于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 菌株的重金屬耐受性馴化

菌株H1 從初始含鎘濃度為15 mg/L 的平板中分離純化，并接種于含鎘濃度30 mg/L 的固體PDA 培養基中27 ℃生長4 d 后，移接至鎘濃度為45 mg/L 的固體PDA 培養基中。以每次重金屬鎘濃度增加量15 mg/L 為周期，于27 ℃下恒溫培養，每隔4 d 轉接至下一濃度梯度，增加至固體PDA 培養基內鎘濃度為150 mg/L，直至完成本輪重金屬耐受性馴化。再以鎘濃度增加量50 mg/L 為周期，27 ℃下培養5 d 后轉接至下一濃度梯度，并逐步增加濃度至培養基內鎘濃度為450 mg/L，上述馴化過程每組均做3 次以上轉接。將馴化后的菌株H1 接種到不含鎘的固體培養基上，27 ℃培養箱培養7 d 后進行保種，并于5 ℃冰箱中保存備用。

1.2.4 菌株的分子鑒定

將菌株H1 接種于固體PDA 培養基中富集培養后，利用TreliefTMPlant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA，分子鑒定由上海生工生物工程股份有限公司完成。通用引物擴增ITS 序列：正向引物ITS1-TCCGTA-GTGAACCTGGGG，反向引物ITS4-TCCTC-CGCTTATTGATATGC。PCR 擴增反應體系為50 μL，反應條件為：94 ℃，5 min；94℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，50 s；循環35 次；72 ℃，10 min。PCR 擴增產物以1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴增PCR 產物進行測序。將測序結果，通過Blast 軟件在NCBI 數據庫中進行同源比較，選取相似性較高的標準菌株的ITSrDNA 基因序列，利用Clustal X 軟件進行多序列比對，并采用Saitou 和Nei 的鄰接法（Neighbor Joining）用MEGA 軟件進行系統進化樹的構建。

1.2.5 不同重金屬濃度脅迫下菌株的生長曲線

將培養至對數期的耐鎘真菌分別接種至含鎘濃度為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、300 mg/L 的固體PDA 培養基中，并選取10 mg/L 的含砷培養基作為實驗對照，置于室溫25 ℃下培養數日，每組濃度梯度均接種3 個平板以上，每隔12 h 用直尺測量菌落生長直徑，繪制不同濃度鎘脅迫下的微生物生長曲線。

1.3 菌株對鎘的吸附特性研究

1.3.1 菌株生長過程中對鎘的吸附

取100 mL 液體PDA 培養基移至250 mL 錐形瓶中加入Cd2+鎘溶液，使最終錐形瓶內鎘溶液濃度為50 mg/L 后滅菌，從菌落中切出接種基塊（5 mm×5 mm）將其加入到100 mL 液體PDA 培養基中，于室溫下每隔48 h 取樣，實驗設置3 個重復，以只添加CdCl2而不接種菌株的PDA 液體培養基作為對照，定期取樣。收集樣品后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液抽濾后用ICP 測定Cd2+濃度。用吸附量（q）和吸附率（R）表征微生物對鎘的吸附，其計算方法如下[9-10]

式中，ρ0為溶液中Cd2+的初始質量濃度；ρt為吸附t 時間后溶液中Cd2+的質量濃度。

1.3.2 不同pH 下菌株對鎘的吸附

分別選擇pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 作為液體PDA 培養基初始的pH，加入鎘溶液，使最終錐形瓶內鎘溶液濃度為50 mg/L 后滅菌，從菌落中切出接種基塊（5 mm×5 mm）將其加入到100 mL 液體PDA培養基中，180 r/min、25 ℃搖床培養。培養至11 d 取菌懸液5 000 r/min 離心10 min 去除菌體，收集上清液后抽濾，用ICP 測定上清液的Cd2+濃度。

2 結果與討論

2.1 菌株的形態特征

圖1 為菌株H1 菌落形態圖，在PDA 平板上，培養初期H1 菌落為純白色，絨毛狀，生長較慢。5 d 后菌體表面呈粉白色，菌落邊緣呈現粉色，有色素產生，背面逐漸變為褐紅色且隨培養時間增加而顏色加深。在培養基表面逐漸形成絲束交織的厚膜，呈片狀且具有一定粘性，用接種針不易挑下。

圖1 菌株H1 的菌落形態(a)和微分干涉顯微鏡下的形態（放大倍數10×40）(b)

2.2 菌株的分子生物學鑒定

通過ITS 基因同源分析、系統發育分析結果得出，H1 與Epicoccum sorghinum 聚類在一起，且分支置信度為100%，因此H1 為Epicoccum sorghinum。

2.3 不同重金屬濃度脅迫下真菌的生長曲線，見圖3

圖3 不同重金屬濃度下菌株H1 的生長曲線

重金屬鎘的生物毒性較強，會隨著鎘濃度上升對馴化后菌株H1 菌絲生長繁殖起抑制作用。菌株H1受重金屬Cd2+脅迫的程度隨著Cd2+添加濃度的不同而有一定差異。在不含Cd2+的培養基中，菌株H1 于5 d 達到對數生長期。在Cd2+濃度為50 mg/L 時，經馴化后的菌株H1 的菌絲生長速度明顯大于另外3 組高濃度中的菌株。而Cd2+濃度為100 mg/L 以上時會起一定刺激作用，在60～144 h 尤為明顯。

圖2 菌株H1 的系統發育樹狀圖

這表明經馴化后的菌株H1 可以耐一定量的重金屬鎘，在鎘濃度相對較低的條件時，菌株H1 生長雖受到重金屬的生物毒性而被抑制，但細胞仍有活性，其用于吸附重金屬鎘的菌絲在固體條件下仍能以相對較快的速度完成正常的生長發育。對比10 mg/L 砷離子對菌株H1 的脅迫作用，低濃度砷離子相較高濃度的鎘離子對該菌株的生長抑制不大，菌株H1 可以在較低濃度砷的條件下正常生長。因此可將H1 接種于含鎘的液體PDA 培養基中進一步測定其生長過程中對鎘離子的吸附效果。

2.4 菌株生長過程中及不同pH 條件下對鎘的吸附性研究

在吸附溫度為27 ℃，自然pH 下、Cd2+質量濃度為50 mg/L 的100 mL 液體PDA 培養基中，菌株H1對于Cd2+的吸附量如圖4（a）所示。菌株H1 對重金屬鎘的吸附量會隨著菌株的穩定生長而增加，在第12 d時菌株H1 的生長達到飽和，在14 d 時溶液內重金屬鎘的濃度小幅上升。這充分說明，Cd2+的濃度變化對菌株的生長具有重要影響；隨著菌株H1 對Cd2+吸附量的增加，細胞表面對Cd2+的吸附逐漸達到飽和，細胞壁上對其產生的斥力也會相應增強，造成金屬離子進一步進入到細胞表面的阻力增大，最后達到相對平衡階段。隨著培養時間的延長，菌株H1 對Cd2+的吸附量略有降低，當培養時間達到14 d 時，表明隨著營養物質消耗殆盡，部分菌體開始老化死亡，甚至出現自溶現象，打破固液吸附的平衡，引起菌體吸附量下降且部分菌體吸附的鎘離子又重新溶解至液體中，導致檢測時溶液中鎘離子濃度小幅度上升。

圖4 菌株H1 生長過程中及pH 環境下對Cd2+的吸附變化

真菌的生存生長等所有的細胞代謝活動與環境pH 息息相關。酸性環境雖然有利于金屬陽離子的溶出和交換吸附，但是過低的環境pH 會產生細胞毒性，影響最終的菌體量[11]。不同pH 下菌株H1 對Cd2+的吸附量見圖4（b）。過酸過堿對菌株H1 生長發育時間有一定抑制作用。pH 在7.0～9.0 時，菌株H1 對Cd2+的吸附量較高（圖4（b））。這些結果表明雖然菌株H1 可以耐受一定的堿性環境，但堿性環境下細胞表面的活性官能基團減少，吸附率也會受到影響。如圖4 所示，菌株H1 在pH=4.0～9.0 范圍內均能吸附Cd2+，最適宜pH 為8.0。

3 結論

大理蒼山地質公園周邊土壤分離純化出的土著耐鎘真菌H1 為Epicoccum sorghinum，該菌可在濃度為300 mg/L 的鎘污染環境中穩定生長。

在初始Cd2+濃度為50 mg/L、溫度為25 ℃、自然pH、振蕩培養條件下，菌體對鎘的最大吸附量為41.73 mg/L，最大吸附率為83.4%；菌株H1 在pH 范圍4.0～9.0 內均可吸附溶液中的重金屬鎘，其最適吸附pH 為8.0，該pH 下吸附量為39.59 mg/L，吸附效率為79.1%。

本研究結果充分說明菌株H1 可在鎘污染濃度較高的條件下存活，并且具備較高的重金屬吸附量，在不同pH 的環境下仍能發揮作用，因此菌株H1 具有一定的重金屬鎘污染環境下的修復應用潛能。