γ-氨基丁酸對大豆種子萌發及根系形態建成的調控效應

強斌斌，金喜軍，周偉鑫，劉 佳，褚霈宇，張玉先

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163319)

大豆富含優質植物蛋白和油分，是我國主要經濟作物之一，在國民經濟和人民生活中占有舉足輕重的地位；其產量表現主要取決于品種特性和環境條件。優良品種和適宜環境條件很大程度上保證了作物產量水平，而采取更加有效的手段進一步挖掘產量潛力是栽培科研工作者追求的目標。壯苗是保證作物高產和穩產的基礎，根粗、根表面積、根體積等形態指標是豆科作物壯苗的關鍵指標[1-2]，因此根系的生長狀況作為壯苗的重要因素之一，對作物產量提高具有重要的意義[3-4]。眾所周知，作物已經在形態、生理、生化和分子水平上進化出各種調控機制來適應多變的環境，以便于物種延續、發展和繁榮。在錯綜復雜的調控機制中，激素調節是非常重要的方面。植物激素參與植物生長發育的每一個階段，包括萌發、營養生長、生殖生長、成熟，控制著各個器官的形態、大小和數量，并對外界環境如溫度、水分、重金屬、蟲害、病害等作出反應，起到協調植株生長發育與環境條件之間關系的作用[5]。除了我們熟知的生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸和乙烯以外，近年來還有一些調節物質被認定為新型植物激素，其中就包括γ-氨基丁酸(GABA)。GABA是一種非蛋白質氨基酸，存在于包括一些植物和動物在內的許多生物中[6]。科研人員首先在馬鈴薯塊莖中發現了天然存在的GABA，而后證實其存在于其他多種植物中[7]。研究表明，植物內源GABA可以作為植物調控生長和發育的內源性信號分子發揮代謝作用[8]；此外，GABA也可參與環境適應行為，如pH的變化、冷和熱休克反應、抗蟲機制和氮代謝[7]，說明植物內源GABA含量的變化與其生長發育狀態存在密切關系。Li等[9]研究表明，外源GABA的施用可以顯著提高玉米根系和地上部幼苗的鮮重；李敬蕊等[10]在研究中發現GABA浸種可顯著促進小白菜生長，提高其生物量，并且影響了作物的硝酸鹽代謝。以上研究說明外源GABA可以影響不同類型的植物和植物的不同生長階段，具有與內源GABA相同的效應。然而，關于外源GABA調控大豆種子萌發及其根系形態建成的研究鮮有報道。

本研究以龍墾310、合豐50為試驗材料，設置不同濃度GABA進行浸種處理，通過萌發和根系形態關鍵指標的比較，明確GABA對大豆種子萌發和根系形態建成的影響；在最佳濃度下比較分析萌發和根系發育關鍵生理指標，明確GABA對大豆萌發和根系發育生理調控效應；最后，結合形態、生理指標結果明確氨基丁酸對大豆種子萌發、根系形態建成的調控效應，以期為實際生產中通過施用外源GABA培育壯苗、提高大豆產量提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用黑龍江主栽大豆品種龍墾310和合豐50為試驗材料，龍墾310為高蛋白品種，無限結莢習性；合豐50為高油大豆品種，亞有限結莢習性。γ-氨基丁酸(GABA)購自sigma公司，分析純。

1.2 試驗設計

試驗于2021年在黑龍江八一農墾大學生物技術中心試驗室內進行。首先挑選大小均勻、無破損和病斑的種子，10%次氯酸鈉消毒15 min后用蒸餾水沖洗5次，在黑暗條件下分別浸泡在濃度為0、5、10、25、50、100 mmol·L-1氨基丁酸溶液中8 h，使其達到吸脹狀態。之后在直徑為9 cm培養皿中，墊兩層無菌濾紙并加入5 ml蒸餾水，每個培養皿放10粒種子，3次重復，置于25℃恒溫培養箱中發芽，培養7 d。每2 d更換一次濾紙，采用稱重法每天補充相應的溶液使濾紙達到濕潤狀態，觀察記錄種子萌發相關的各項指標，于發芽開始后的1、3、4、5、7 d取樣測定萌發相關生理指標，在第7天觀察并測定根系形態指標，篩選出最佳濃度。以最佳濃度為處理濃度，蒸餾水為對照，再次進行發芽和根系觀察試驗，經對比分析進一步明確處理效果。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 萌發指標 處理1 d后開始每天觀察并記錄種子發芽數(以胚根突破種皮達到種子1/2定義為發芽)，并測算萌發指標。

發芽勢=培養n天后發芽數/供試種子數×100%

發芽指數GI=∑(Gt/Dt)

式中，Gt指在t日內的發芽數，Dt為相應的發芽天數(d)。

活力指數VI=GI×S

式中，S為幼苗鮮重(g)。

1.3.2 形態指標 種子萌發第7天使用FGX-A型根系分析系統掃描根系，并用形態學分析軟件winRHIZO分析根長、根面積、根體積、側根數；使用游標卡尺測定根粗，測量點選擇下胚軸與主根的根節處；之后用濾紙吸干根系水分，用萬分之一天平稱量其鮮重。

1.3.3 生理指標 種子萌發第7天取根系及子葉用液氮冷凍后于-80℃保存。超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定，根系活力、游離氨基酸含量的測定參照李小方等[11]方法進行。蒽酮法測定可溶性糖含量[12]，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白質含量[11]。電導率采用電導率儀進行測定。GABA含量基于韓延麗等[13]改良后的顯色反應測定。

1.4 數據處理與分析

數據采用SPSS 20.0進行顯著行分析，使用Prism 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 GABA浸種對大豆種子萌發的影響

由表1可知，不同濃度GABA浸種對合豐50和龍墾310大豆種子發芽率、發芽指數、活力指數均有不同程度的影響。與對照相比，合豐50在5、10、25 mmol·L-1GABA浸種處理下，第1天和第2天的發芽率分別提高了58.8%和25.6%、105.8%和55.7%、88.4%和55.1%；第7天后，各濃度處理間發芽率無顯著差異；發芽指數和活力指數分別提高了16.5%、27.1%、22.5%和28.2%、63.3%、30.7%。100 mmol·L-1GABA浸種處理的發芽指數、活力指數均較對照有所下降。說明適宜濃度的GABA浸種可以顯著提高發芽指數和活力指數，有利于種子提前發芽，而高濃度100 mmol·L-1則會抑制種子萌發。對于龍墾310而言，10 mmol·L-1和25 mmol·L-1外源GABA處理有利于促進其種子的萌發，其中第1天、第2天、第3天發芽率及發芽指數、活力指數較對照組分別提高了39.3%和51.0%、22.6%和33.0%、19.5%和14.9%、12.2%和14.7%、98.9%和77.9%。綜上可知，隨GABA濃度的升高，兩品種的發芽率、發芽指數、活力指數呈先上升后下降的趨勢，10～25 mmol·L-1GABA浸種處理對種子萌發的促進效果最顯著，而濃度過高則起抑制作用，不利于種子的萌發。

表1 GABA浸種對大豆種子萌發指標的影響Table 1 Effects of soaking seeds with GABA on soybean seed germination index

2.2 GABA浸種對大豆根系形態指標的影響

如圖1和圖2所示，不同濃度GABA浸種對合豐50和龍墾310大豆根系各項形態指標的影響有所差異。10 mmol·L-1GABA浸種處理對兩品種的根長、側根數、根鮮重促進顯著，較對照組分別提高了27.3%和27.1%、93.4%和90.5%、28.5%和77.2%，其中側根數增加最明顯。GABA對兩品種的根表面積和根體積調控存在差異，合豐50在25 mmol·L-1GABA浸種處理下根表面積和根體積分別較對照處理提高了32.7%和22.7%；與對照相比，龍墾310在5 mmol·L-1GABA浸種處理下根表面積增加效果最顯著，增幅為35.8%，濃度為25 mmol·L-1對根體積提升效果最顯著，增幅為20.9%。高濃度100 mmol·L-1時合豐50根長、根表面積、根體積較對照分別降低了58.5%、42.9%、34.6%，龍墾310根長、根表面積較對照分別降低了59.4%、37.0%。不同的是，合豐50和龍墾310根粗隨GABA浸種濃度的增加呈逐漸增加后平穩的趨勢，100 mmol·L-1濃度處理分別較對照處理增加了37.9%和23.6%。以上結果表明，適宜濃度的GABA浸種處理對大豆根長和側根數可起到顯著促進作用，高濃度GABA則起抑制作用。

注: 圖中的2 cm代表根系標尺。Note: The 2 cm in the figure represents the root scale.圖1 GABA浸種對大豆根系表型的影響Fig.1 Effects of soaking seeds with GABA on root phenotype of soybean

注: 不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05) ，下同。Note: Different lowercase letters represent significant differences among treatments (P<0.05)，the same below．圖2 GABA浸種對大豆根系形態指標的影響Fig.2 Effects of soaking seeds with GABA on root morphological indexes of soybean

2.3 GABA浸種對大豆根系活力、電導率的影響

如圖3所示為不同濃度GABA浸種對大豆根系活力和電導率的影響。合豐50和龍墾310在10 mmol·L-1濃度時的根系活力顯著高于對照組，增幅分別為26.8%和21.3%，而濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1時對根系活力產生抑制現象。2個品種電導率在5、10、25 mmol·L-1濃度時顯著低于對照處理，而在100 mmol·L-1濃度下顯著高于其他處理。說明10～25 mmol·L-1外源GABA浸種可以顯著增加大豆根系活力，降低根系電導率，濃度過高，可能導致膜透性增大，表現出抑制效果。

圖3 GABA浸種對大豆根系活力與電導率的影響Fig.3 Effects of soaking seeds with GABA on root activity and electrical conductivity of soybean

2.4 GABA浸種對大豆根系抗氧化酶活性的影響

如圖4所示為GABA浸種對大豆根系抗氧化酶活性的影響，可以看出，外源GABA浸種可改變大豆根系抗氧化酶活性。隨GABA濃度增加，合豐50和龍墾310抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性均呈先上升后下降趨勢，濃度為10 mmol·L-1時增加效果最顯著，分別較對照提高了91.3%和88.3%、38.5%和33.3%、48.7%和35.8%、64.3%和46.2%。GABA濃度大于25 mmol·L-1時，抗氧化酶活性出現緩慢下降趨勢。以上結果表明，10 mmol·L-1濃度GABA浸種處理能夠顯著提升大豆萌發期間根系抗氧化酶活性，促進根系生長發育，而高濃度100 mmol·L-1GABA浸種處理導致抗氧化酶活性變化不顯著或者降低，不利于根系生長發育。

圖4 GABA浸種對大豆根系抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of soaking seeds with GABA on antioxidant enzyme activities in soybean roots

2.5 GABA浸種對大豆種子萌發期代謝物質的影響

如圖5所示為不同濃度GABA浸種對大豆萌發期間子葉與根系代謝物質及滲透調節物質的影響。可溶性糖與可溶性蛋白是植物新陳代謝的重要產物，圖5(A、B)為GABA對大豆根系及子葉中可溶性糖與可溶性蛋白含量的影響。不同濃度GABA對兩品種可溶性糖與可溶性蛋白影響趨勢一致。隨GABA濃度的增加，合豐50子葉和根系中的可溶性糖與可溶性蛋白均呈先上升后下降的趨勢，且均在10 mmol·L-1濃度時含量最高，與對照相比，子葉增幅為54.23%和22.33%，根系增幅為17.46%和26.14%。

圖5 GABA浸種對大豆子葉和根系謝物質含量的影響Fig.5 Effects of soaking seeds with GABA on metabolites content in cotyledons and roots of soybean

100 mmol·L-1處理時，子葉可溶性蛋白含量與對照無顯著差異，而根系可溶性糖與可溶性蛋白含量顯著低于對照。如圖5(C、D)所示，外源GABA浸種顯著改變子葉與根系內源GABA的含量，合豐50子葉與根系內源GABA含量和游離氨基酸含量均隨GABA濃度的增加呈先上升后降低的趨勢。其中，10 mmol·L-1濃度處理的內源GABA含量與游離氨基酸含量達到最大值，與對照組相比，子葉中的GABA含量和氨基酸含量分別增加了37.7%和45.3%，根系分別增加了44.3%和9.52%。龍墾310各指標表現趨勢與合豐50基本相同，但相同濃度下合豐50子葉與根系中的可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸含量均高于龍墾310。以上結果表明，在大豆種子萌發期間，10 mmol·L-1GABA浸種對子葉與根系代謝、種子萌發和根系生長的促進效果顯著，在合豐50上表現更明顯。

3 討 論

γ-氨基丁酸(GABA)作為一種四碳非蛋白質氨基酸，在植物中擔任代謝物質和信號物質的雙重角色[6]。外源GABA通過調控植物信號轉導、轉錄調控、激素合成、活性氧生成和多胺代謝等相關基因的表達，可提高植物抗逆能力[14]。無論在應激條件還是非應激條件下，外源GABA被植物吸收后，其作用方式與內源GABA相同[15]，對不同植物類型和植物不同生長階段均可起調控作用[16]。外源GABA可調控脫落酸和乙烯生物合成，脫落酸具有促進種子休眠的作用，乙烯具有促進種子萌發的作用。近年來，大量研究表明，GABA浸種可提高種子發芽率、發芽速度，促進胚軸和胚根的生長，且不同物種間的濃度響應有所差異[17-18]。本研究發現隨GABA浸種濃度增加，大豆種子在萌發期間內源GABA含量和游離氨基酸含量呈先上升后下降趨勢，10 mmol·L-1濃度處理下內源GABA含量較對照處理增加最顯著，同時該濃度下大豆的發芽勢、發芽指數和活力指數也顯著提高。這可能是因為適宜濃度的GABA可以降低ABA的含量，提高乙烯含量，進而調控內源激素促進種子的萌發。這與施征等[19]研究得出的10 mmol·L-1外源GABA能提高種子萌發率，而高濃度GABA具有抑制作用的研究結果一致。

種子萌發過程中各種代謝活動會產生活性氧(ROS)，對細胞膜、核酸、蛋白質等大分子物質產生破壞作用[20]。活性氧的產生往往會造成細胞膜的損傷及各種細胞結構和細胞器的解體，最終導致細胞死亡[21]。GABA在植物中具有清除活性氧的作用[8]，已有研究證明GABA可以顯著提高水稻、黑麥草等作物中多種抗氧化酶活性[22-23]。本研究發現適宜濃度(10 mmol·L-1)的GABA浸種處理可顯著提高根系SOD、POD、CAT、APX活性，可能是因為GABA誘導的抗氧化活性的變化，有助于增強抗氧化酶的活性，提高細胞清除ROS的能力，從而維持了細胞完整性[24]。本試驗結果與 Li等[9]的結果一致，即適宜濃度的GABA提高了作物中各種抗氧化酶的活性，清除ROS的產生。也有研究顯示，在MS培養基上用外源GABA抑制了擬南芥幼苗根系的伸長，而用1/8的培養基培養可以促進根系的伸長，這可能與硝酸鹽的水平不同有關[25]。

淀粉的分解代謝過程為種子的萌發和根系的生長提供有效的碳水化合物，可溶性糖對維持細胞的充盈度和能量供應起了重要的作用[26]；而可溶性蛋白作為重要的滲透調節物質和營養物質，對參與細胞建成的生命物質及生物膜具有保護作用[27]。有研究表明，GABA可誘導淀粉分解，為白三葉種子萌發和生長提供有效的碳水化合物[26]。本研究結果表明在大豆萌發期間，無論是子葉還是根系，可溶性糖和可溶性蛋白含量均隨外源GABA濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，其含量在10 mmol·L-1濃度處理時達到最高。說明適宜濃度GABA浸種可促進淀粉代謝，提高大豆子葉和根系可溶性糖和可溶性蛋白的含量，為種子萌發提供更多碳水化合物。這可能是因為GABA與激素相互作用，調控了種子內部蛋白和糖類代謝，從而促進種子萌發[28]。

根系活力是客觀反映根系生命活動重要的生理指標，體現了根系吸收水分和營養物質的能力[29]；根系的形態特征體現了其對水分、礦質養分的吸收效率。側根的數量和位置決定了根系的大小和結構，根系結構特征對作物產量有很大的影響[4]。有研究發現GABA可以調控脫落酸和乙烯并誘導根系所需生長素的生物合成[30]，且證明IAA/ABA誘導鋁活化的蘋果酸轉運蛋白(ALMT)家族基因在根尖表皮細胞的質膜上表達[31]。此外，GABA對ALMT活性的調節導致了根系生長的變化，改變根系pH。本研究結果表明，外源10 mmol·L-1GABA提高了根系活力，促進總根長、側根數及根表面積增加，而高濃度明顯抑制了主根的生長與側根的形成。可能是因為GABA與乙烯、脫落酸和生長素等激素產生互作效應，共同調控種子的萌發與根系的生長；也可能是因為GABA作為一種可被根系吸收的氨基酸態氮源，參與硝酸鹽吸收，適量濃度的GABA處理可促進植物體對硝酸鹽的吸收，刺激根系伸長[32]。綜合來看，適宜外源GABA浸種可能通過調控內源GABA與其他激素間的互作效應或參與硝酸鹽的吸收，促進種子的萌發和根系的生長與發育，而濃度過高時會抑制這種效果，這與Renault等[33]在擬南芥中研究發現的高濃度對下胚軸和初生根有抑制作用的研究結果一致。

4 結 論

適宜濃度的GABA浸種可提高大豆種子發芽指數和活力指數，增加根長、側根數、根表面積，提高種子萌發過程中抗氧化酶活性、根系活力和代謝活性，有利于種子萌發和根系形態建成。綜合分析發現，對于合豐50和龍墾310，10 mmol·L-1的GABA浸種濃度對其種子萌發及根系形態建成的促進效果最佳。