油菜不同還田量對新疆鹽堿土壤線蟲群落的影響

楊 濤,陳 虹,張鳳華

(石河子大學，新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆 石河子 832003)

土壤線蟲是土壤生態系統的重要組成部分，能夠通過調控物質的分解和轉化影響土壤環境[1-2]。除此之外，線蟲還能通過影響生長素和赤霉素等其他物質的含量以調節土壤環境[3]。因此土壤線蟲常被看作是評價土壤環境和植物條件的指示生物[4]。在農田管理措施中，耕作、灌溉以及施肥等都能改變土壤肥力及土壤微生物特性，從而影響線蟲群落[5]。已有研究表明，油菜等秸稈還田可顯著提高紫色土中線蟲、蚯蚓等土壤動物數量[6]。

據調查，新疆鹽堿地面積占可耕地總面積的32.07%[7]，因此，鹽堿改良是我國目前要解決的重大難題。近年來，綠肥還田作為一項新興的生物改良技術，能夠提升土壤肥力、改善土壤環境、提高后茬作物產量[8]。有研究表明，油菜和紫云英還田能夠提高土壤有機質和有效氮、磷的含量以及水稻產量。油菜作為十字花科蕓薹屬作物，其抗逆性強、適應性廣[9]。油菜作綠肥可以提高土壤肥力，還能降低土壤鹽分含量[10]；此外，油菜所含的硫甙類物質能夠有效抑制雜草及病蟲害，根系的分泌物可增強土壤微生物活性[11]。

目前對油菜作綠肥的研究主要集中在養分釋放及種植技術等方面[12]，而針對油菜還田后線蟲群落變化特征的研究相對較少。因此本試驗采用高通量測序技術對新疆鹽堿土壤油菜作綠肥還田后的土壤線蟲群落進行研究，闡明油菜還田對土壤線蟲群落結構的影響，揭示影響土壤線蟲群落結構變化的主要環境因子，為新疆鹽堿土壤生物改良提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于新疆生產建設兵團第八師石總場(44°27′47″N，86°0′54″E)，光照充足，雨量稀少，屬于典型的溫帶大陸性氣候。該區年平均氣溫6.6℃，年平均降水量180 mm，年平均蒸發量1 600 mm，年平均日照時數2 784 h，年平均無霜期166 d，≥0℃積溫3 918℃。該區域地下水位較高，強烈的蒸發使得土壤鹽分表聚，耕層土壤鹽漬化程度較重。2020年10月測定研究區土壤理化性質如表1所示。

表1 研究區土壤理化性質(2020年)Table 1 Physical and chemical properties of soil in the study area (2020)

1.2 試驗設計

試驗于2020年7月15日進行油菜播種。油菜品種為‘華油雜62號’(甘藍型油菜，由華中農業大學提供)，播種量為15 kg·hm-2，滴灌栽培。播種時施用重過磷酸鈣300 kg·hm-2，出苗后30 d開始隨水追施尿素，全生育期澆水6～7次，其他田間管理與實際生產一致。于2020年10月17日進行油菜打桿，10月27日進行油菜粉碎翻壓還田，油菜地上部鮮重為84 000 kg·hm-2。試驗設置油菜不還田(CK)、還田量21 000 kg·hm-2(T1)、還田量42 000 kg·hm-2(T2)、還田量84 000 kg·hm-2(T3)4個處理。每個處理設置3次重復，共計12個小區，小區面積為5 m×5 m=25 m2，采取單因素完全隨機區組設計，每兩小區之間均設置2 m保護行。

1.3 樣品采集

于2021年7月7日進行土壤樣品采集，取樣深度為0～20 cm耕層土壤。采用五點混合取樣法進行取樣，各處理的3個重復小區分別隨機選取5個樣點，將5個樣點土樣去除動植物殘體及石塊等雜物后均勻混合(3次重復進行平均)，置于透明無菌自封袋內，放入冰盒冷藏，并及時帶回實驗室。土壤樣品過1 mm土篩后分為2份，一份儲存在-80℃冰箱中用于線蟲群落的分析，另一份自然風干后用于土壤理化性質的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 土壤理化性質測定 土壤容重采用環刀法進行測定；土壤含水率采用烘干法進行測定；土壤pH采用哈希HQ411d臺式酸度計進行測定(蒸餾水浸提，水土比為5∶1)；土壤電導率采用雷磁DDSJ-308F型電導率儀進行測定(蒸餾水浸提，水土比為5∶1)；土壤總鹽含量采用殘渣烘干-質量法測定；有機質采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定：堿解氮采用堿解擴散法測定；速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度計法測定[13]。

1.4.2 土壤DNA提取、PCR擴增及高通量測序 采用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO UltraCleanTM)從0.5 g土壤樣品中提取總DNA，保存于-20℃冰箱中備用。利用凝膠電泳檢測基因組DNA，使用酶標儀測定其濃度和純度。對樣品進行序列檢測擴增，擴增區域為NF1F_18Sr2bR，擴增片段長度為350 bp。PCR產物利用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega 公司，美國)進行定量，混合后進行Miseq文庫構建、拼接質控、OTU聚類及生信分析。采用Miseq PE300平臺進行序列的測序及分析(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.4.3 土壤線蟲群落分析 根據土壤線蟲的特征結構及捕食習性將其分為4個營養類群：食細菌類線蟲(Bacterivores)、食真菌類線蟲(Fungivores)、植物寄生類線蟲(Plant-parasites)和捕食雜食類線蟲(Omnivores-predators)；并根據線蟲的食性和生活策略劃分不同的生活史c-p值。每100 g土壤中食細菌類線蟲、食真菌類線蟲、植物寄生類線蟲和捕食雜食類線蟲占線蟲總數比例為各營養類群的相對豐度；根據土壤線蟲的分類結果計算其生態指數，即：

(1)線蟲通道指數(nematode channel ratio, NCR)：NCR=B/(B+F)。式中，B為食細菌類線蟲所占比例；F為食真菌類線蟲所占比例。

(2)自由生活線蟲成熟度指數(maturity index of free-living nematodes, MI)；植物寄生類線蟲成熟度指數(plant parasite index, PPI)：MI(PPI)=∑vi×fi。其中，vi為自由生活線蟲(或植物寄生類線蟲)被賦予的c-p 值，fi為第i種線蟲的數量占群落總數的比例。

(3)富集指數(EI)：EI=100×e/(b+e)；結構指數(SI)：SI=100×s/(b+s)；式中，b代表食物網基礎成分，指Ba2和Fu2這兩個類群；e代表食物網富集成分，指Ba1和Fu2這兩個類群；s代表食物網結構成分，包括Ba3-Ba5、Fu3-Fu5、Om2-Om5類群(其中Ba2代表食細菌類線蟲中c-p值為2的線蟲數量，Fu2代表食真菌類線蟲中c-p值為2的線蟲數量，Om2代表捕食雜食類線蟲中c-p值為2的線蟲數量)。

1.5 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2021對土壤理化結果進行整理，采用SPSS 26進行方差分析和相關性分析，采用Duncan法檢驗處理間差異顯著性(P<0.05)。

高通量測序結果使用Fastp 0.19.6 進行質控，采用Flash 1.2.11進行雙端序列拼接獲得有效數據。使用QIIME軟件包挑選各OTU的代表序列，并將其與數據庫進行對比注釋。采用Uparse 7.0.1090軟件按照97%相似性進行OTU聚類，各OTU中豐度最高的序列為代表序列，所有樣本的覆蓋率均高于99.7%。采用RDP Classifier 2.11貝斯葉算法對97%相似性的OTU代表序列進行序列分類注釋，設置信度閾值為0.7，與NT(Nucleotide Sequence Database)數據庫進行數據比對。采用Origin 2021對群落組成作圖。采用Mothur 1.30.2對優化序列提取非重復序列，在97%相似水平分析樣品多樣性指數。采用主坐標分析(PCoA)分析油菜不同還田量處理土壤線蟲群落組成差異。利用方差膨脹因子(VIF)篩選環境因子，對土壤理化性質及土壤線蟲群落結構進行冗余分析(RDA)。

2 結果與分析

2.1 油菜不同還田量土壤理化性質

從表2可以看出，與CK相比，油菜各還田處理均顯著降低了土壤容重、pH、EC及總鹽含量(P<0.05)。土壤含水率隨著還田量的增加逐漸上升，T3處理最高，較CK增加了23.66%。與CK相比，油菜各還田處理均顯著增加了土壤有機質含量，T2處理最高，較CK增加了27.42%。T3處理土壤堿解氮與速效鉀含量均顯著高于其他處理(P<0.05)，與CK相比分別增加了35.46%和11.12%；而土壤速效磷含量在T2處理時最高，與CK相比增加了56.48%，且與其他處理之間差異顯著(P<0.05)。

表2 油菜不同還田量土壤理化性質Table 2 Soil physiochemical properties in different rapeseed returning amounts

2.2 油菜不同還田量土壤線蟲群落

對各樣本土壤線蟲進行高通量測序，保留了217 864條有效序列，有效序列長度為220～434 bp，平均序列長度為320 bp?；?7%的序列相似性進行聚類，所有樣品中共檢測出40個OTU，被劃分為3綱3目13科19屬24種。其中食細菌類線蟲5屬，食真菌類線蟲4屬，植物寄生類線蟲3屬，捕食雜食類線蟲4屬，未分類線蟲3屬。

從圖1a可以看出，各處理中相對豐度≥1%的線蟲科共有4個，分別為：頭葉科(Cephalobidae)、孔咽科(Aporcelaimidae)、盆咽科(Panagrolaimidae)和異皮科(Heteroderidae)。各處理土壤線蟲的主要線蟲科均是頭葉科，在T1處理相對豐度最高，達89.98%；在T3處理最低，為81.97%。隨著還田量的增加，孔咽科的相對豐度呈下降趨勢，異皮科則相反。粒科(Anguinidae)與刺科(Belonolaimidae)僅在油菜還田處理中被檢測出。

屬水平土壤線蟲群落組成如圖1b，平均相對豐度≥1%的線蟲屬共有5個，分別為：擬麗突屬(Acrobeloides)、麗突屬(Acrobeles)、無環屬(Aporcella)、盆咽屬(Panagrolaimus)和刻點胞囊屬(Punctodera)。其中，擬麗突屬在所有處理中均為優勢屬(平均豐度>75.00%)，在T1處理中相對豐度最高，達87.75%。無環屬的相對豐度隨還田量的增加逐漸下降，T3處理最低，較CK降低了99.82%。而刻點胞囊屬的相對豐度則隨著還田量的增加而升高。米卡墊刃屬(Miculenchus)與刺屬(Belonolaimus)僅在還田處理中被檢測出。

圖1 不同還田量下線蟲科(a)和屬(b)的相對豐度Fig.1 Relative abundance of nematode family (a) and genus (b) in different returning amounts

不同還田量處理土壤線蟲各營養類群的相對豐度如圖2所示。所有處理優勢營養類群均為食細菌類線蟲，T2處理下其相對豐度最高，隨后呈下降趨勢；捕食雜食類線蟲的相對豐度隨還田量的增加呈下降趨勢，而食真菌類線蟲與植物寄生類線蟲的相對豐度逐漸升高。

圖2 不同還田量下土壤線蟲各營養類群相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil nematode in different returning amounts

通過分析不同還田量處理線蟲群落的豐富度指數、多樣性指數、線蟲通道指數、成熟度指數等發現，所有處理覆蓋度均大于0.9970(表3)，這說明測序數據合理，能夠較真實地反映油菜還田后土壤樣本的線蟲群落特征。如圖3所示，Chao1指數與ACE指數均隨著還田量的增加而降低，CK處理最高，T3處理最低；T3處理Chao1指數和ACE指數較CK分別降低41.07%和35.44%。Shannon指數在T2處理最高，T1處理最低，而Simpson指數則相反。從表3可以看出，自由生活線蟲成熟度指數MI隨著還田量的增加呈下降趨勢，CK處理最高，T3處理最低，T3較CK降低了16.80%；與CK相比，油菜還田處理植物寄生線蟲成熟度指數PPI均有所增加，處理間差異不顯著(P>0.05)；油菜還田處理富集指數EI均低于CK但處理間差異不顯著，而結構指數SI較CK均顯著降低(P<0.05)。

表3 油菜不同還田量下土壤線蟲生態指數Table 3 Ecological index of soil nematodes in different returning amounts

圖3 不同還田量下土壤線蟲多樣性指數Fig.3 Diversity index of soil nematodes in different returning amounts

如圖4所示，在OTU水平上進行PCoA分析，2個主成分坐標軸共解釋了總變異的91.73%，PCoA1和PCoA2分別解釋了總變異的77.24%和14.49%。說明不同處理之間土壤線蟲群落存在差異。

圖4 不同還田量土壤線蟲群落組成主坐標(PCoA)分析Fig.4 Principal co-ordinates analysis (PCoA) of soil nematode community composition in the treatments with different returning amounts

2.3 土壤理化性質對線蟲群落的影響

利用方差膨脹因子VIF分析篩選，保留了土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀和含水率等環境因子。如圖5為土壤理化性質與土壤線蟲群落結構間的冗余分析(RDA)。RDA1和RDA2共同解釋了線蟲群落總變異的97.94%，分別解釋了總變異的93.74%和0.24%。土壤有機質(R2=0.666，P=0.005)和速效鉀(R2=0.845，P=0.001)是影響土壤線蟲群落結構的主要土壤環境因子(圖5，表4)。

注：SOM:有機質;AN:堿解氮;AP:速效磷;AK:速效鉀;MC:含水率。注：SOM:Soil organic matter; AN:Alkali hydrolyzed nitrogen; AP:Available phosphorus; AK:Available potassium; MC:Moisture content.圖5 土壤理化性質與線蟲群落間的冗余分析(RDA)Fig.5 Redundancy analysis (RDA) of soil physical and chemical properties and soil nematode communities

表4 Envfit環境因子表Table 4 Envfit environmental factor table

表5為土壤理化性質與土壤線蟲群落生態指數的相關性。Chao1指數和Simpson指數與土壤EC呈顯著正相關，與土壤堿解氮顯著負相關；自由生活線蟲成熟度指數MI和結構指數SI與土壤pH、EC及總鹽含量呈極顯著正相關，與土壤堿解氮呈極顯著負相關。

表5 土壤理化性質與土壤線蟲生態指數的相關系數Table 5 Correlation coefficients between soil physiochemical properties and soil nematode ecological index

3 討論與結論

3.1 油菜不同還田量對土壤理化性質的影響

本研究結果表明，油菜還田顯著降低了土壤容重、pH、EC和總鹽含量，且隨著油菜還田量的增加，土壤含水率呈上升趨勢。已有研究表明油菜能夠通過自身代謝合成大量有機酸，從而調節自身的滲透平衡。當油菜翻壓還田后，其體內的有機酸進入土壤中，加之微生物對油菜植株的分解也會產生部分有機酸，從而降低了土壤pH[14]。還有研究表明綠肥還田能夠增加土壤孔隙度，從而疏松土壤，降低土壤容重[15]。綠肥還田后還能與土壤顆粒膠結形成穩定的團粒結構，從而增強土壤透氣性和透水性[16]。土壤鹽分含量下降可能是由于油菜對土壤Na+的吸收能力顯著高于其他作物，種植并翻壓油菜可以顯著降低土壤含鹽量和Na+含量[10]。

本研究還表明油菜還田能提高土壤養分含量，這與鄧力超等[17]的研究結果一致。油菜還田后能產生大量可溶性有機物，并將自身的多種元素歸還到土壤當中，提供多種有效養分，促進土壤養分的循環[18]。與CK相比，不同還田量處理速效磷含量均顯著提高，這是因為油菜還田能活化土壤中的難溶性磷，使得土壤有效磷含量增加[19]。除此之外，油菜還田還能通過提高土壤酸性磷酸酶的活性來提高土壤有效磷含量[20]。

3.2 油菜不同還田量對土壤線蟲群落的影響

相對于形態學鑒定，高通量測序技術的發展及應用為土壤生物群落研究提供了新途徑[21]。本研究通過高通量測序對土壤線蟲進行了鑒定，研究結果表明，食細菌類線蟲與捕食雜食類線蟲的相對豐度隨著還田量的增加呈下降趨勢，而食真菌類線蟲與植物寄生類線蟲的相對豐度呈上升趨勢。有研究表明秸稈還田過程中能產生大量真菌，從而使其相對豐度增加[22]。捕食雜食類線蟲對土壤擾動響應極為敏感，油菜還田過程中對土壤的擾動可能會使其相對豐度降低甚至導致一些屬消失。葉成龍等[5]研究發現施用有機肥能增加土壤植物寄生類線蟲的相對豐度，這可能是還田增加了植物生物量，形成了更多的取食位點，有利于植物寄生類線蟲的取食與繁衍，進而增加其相對豐度[23]。

線蟲生態指數能全面地反映線蟲群落之間的差異。本研究結果表明油菜還田降低了土壤線蟲群落的豐富度，提高了線蟲群落的多樣性，且部分屬如米卡墊刃屬與刺屬僅在還田處理中被檢測出，說明油菜還田提高了食物網的復雜性，使生態系統趨于成熟穩定。本研究結果表明所有處理線蟲通道指數NCR均大于0.5，說明有機物質分解主要以細菌分解為主。自由生活線蟲成熟度指數MI隨著還田量的增加而下降，而植物寄生線蟲成熟度指數PPI呈上升趨勢。這可能是由于油菜還田增加了植物對線蟲取食的承載能力，使得植物寄生類線蟲成熟度指數PPI增加[24]。富集指數EI與結構指數SI可以指示土壤環境所受到的擾動和食物網的狀況。本研究發現富集指數EI與結構指數SI較CK均有所下降，T3處理最低，這可能是由于油菜還田借助機械耕作，對土壤擾動程度較高，使得土壤處于脅迫狀態，原本食物網遭到破壞，其抗外界干擾能力變弱。

3.3 土壤理化性質對線蟲群落的影響

土壤理化性質的變化會影響土壤線蟲群落結構，不同的理化性質對線蟲群落有著不同影響。本研究通過RDA冗余分析，表明土壤有機質和土壤速效鉀是影響土壤線蟲群落變化的主要環境因子。Chao1指數與土壤EC呈顯著正相關，與土壤堿解氮呈顯著負相關，這與陳麗燕等[25]的研究結果一致。已有研究表明土壤線蟲與土壤有機質的分解和土壤物質能量循環密切相關[6]，因為油菜還田增加了土壤有機質含量，使得線蟲食物來源更加豐富，促進了土壤食物網結構化，從而增加其多樣性。盧焱焱等[26]對紅壤線蟲群落的研究表明，微生物量碳和有效氮更能影響土壤線蟲群落組成。這些環境因子的差異可能與試驗地土壤及氣候條件、試驗處理及方法等因素不同有關。

綜上所述，油菜還田能降低土壤容重及鹽分含量，改善土壤結構，培肥效果顯著；油菜還田還降低了食細菌類線蟲的相對豐度，提高了食真菌類線蟲與植物寄生類線蟲的相對豐度，增加了土壤線蟲群落的多樣性和復雜性，降低了土壤線蟲群落的結構指數。影響土壤線蟲群落變化的主要環境因子為土壤有機質和速效鉀。