丹參萌發期抗旱性鑒定及抗旱指標篩選

張紅瑞，張麗欣，李夢荷,2，何立威，楊丹丹，高致明

(1.河南農業大學農學院,河南 鄭州 450046；2.新鄉市農業科學院,河南 新鄉 453000；3.河南省農業科學院長垣分院，河南 長垣 453400)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草屬植物，其干燥根及根莖為我國常用的大宗藥材[1]，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等功效[2-3]。萌發期是丹參整個生育期的第一個關鍵階段，直接影響其以后的生長發育與產量形成[4-6]。目前河南地區多采用育苗移栽的方式種植丹參，通常在第1年3—10月間播種育苗，10—11月初或第2年春季移栽。春播時，剛出土幼苗生長能力差，春季氣溫升高、光照增強，土壤容易失水；秋播時氣溫降低，雨水減少，常造成死苗[7]；夏播時，氣候炎熱、地表溫度高，受干旱影響而導致出苗率低、幼苗生長緩慢[8]，因此干旱是目前該地區丹參栽培面臨的主要問題之一。已有研究表明，適宜濃度的引發劑引發種子[7-8]和種子包衣[9]能提高丹參的發芽率及其抗旱性。選育萌發期抗旱性強的丹參種質，鑒定其抗旱性是提高河南地區丹參產量和質量的有效途徑之一。

目前，國內外關于玉米、大麥、小麥、水稻等[10-13]作物的抗旱性鑒定和指標篩選報道較多，而關于丹參的抗旱性研究相對較少。不同栽培類型因其遺傳背景、育種目標及栽培方式的不同，抗旱性表現各異。因此，鑒定丹參種質的抗旱性，篩選抗旱指標，培育抗旱品種非常必要。種子萌發期是植物生命史中最為重要的階段，是對外界滲透脅迫響應比較敏感的時期，逆境條件下植物在這一時期的表現對農藝性狀及產量具有決定性的作用，是進行抗旱性研究的重要時期[14]，且在這一時期進行抗旱性研究具有省時、容量大、環境因素影響小等優點。因此本研究采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬不同程度的干旱脅迫，研究丹參發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長、子葉長、子葉寬、十芽重等指標對干旱脅迫的響應，并通過主成分分析、相關性分析和隸屬函數分析等綜合分析方法明確不同丹參栽培類型的抗旱性，篩選丹參萌發期抗旱指標，為丹參抗旱性評價體系的建立及抗旱性育種奠定基礎。

1 試驗設計

1.1 試驗材料

供試5份材料為課題組從前期收集的丹參野生種質資源中篩選獲得(表1)。各類型間性狀差異明顯、性狀穩定、整齊度高，適宜在河南省洛陽、南陽、三門峽等地區及類似生態類型區域種植。根段繁殖擴繁后收集種子，選用色澤一致、外觀均一、籽粒飽滿、無病蟲害的5個丹參栽培類型健康種子為供試材料。

表1 試驗材料Table 1 Tested material

1.2 PEG溶液配制

參照原小燕等[15]的配制方法分別將30、60、90、120 g PEG-6000溶解在1 000 mL蒸餾水中，即得到 3%、6%、9%、12%的PEG-6000溶液。本次萌發試驗PEG-6000脅迫濃度設置及材料選擇，均在前期預試驗基礎上進行。預試驗內容如下：PEG-6000脅迫濃度為5%、10%、15%、20%、25%，基于丹參出苗率得出PEG-6000適宜脅迫濃度范圍為0%～15%。

1.3 試驗設計

挑選大小一致、種粒飽滿、外表完整的5種栽培類型丹參種子各150粒(3次重復，每次重復50粒)，用1%高錳酸鉀溶液消毒，蒸餾水沖洗干凈置于直徑為10 cm的培養皿中，培養皿底層平鋪雙層濾紙作為發芽床。分別加入10 mL蒸餾水、3 g·mL-1的PEG-6000溶液、6 g·mL-1的PEG-6000溶液、9 g·mL-1的PEG-6000溶液、12 g·mL-1的PEG-6000溶液，形成PEG-6000濃度分別為0%、3%、6%、9%、12%的5個處理，25℃恒溫培養。從種子置床之日起開始觀察，以胚根突破種皮1 mm、胚芽為種子長1/2為發芽標準，定時記錄發芽的丹參種子數，記錄時長為10d。

1.4 調查項目

1.4.1 種子發芽率 種子置床后第10 天取出培養皿，調查參試材料各處理每個重復的發芽數，并計算發芽率。

發芽率(%)=第10天發芽種子數/供試種子數×100%

1.4.2 種子發芽勢 種子置床后第5天取出培養皿，調查參試材料各處理每個重復的發芽數，并計算發芽勢。

發芽勢(%)=第5天發芽種子數/供試種子數×100%

1.4.3 胚根長、胚芽長、子葉長、子葉寬 各材料種子置床后第10天，各處理每個重復隨機取30粒發芽種子測定胚根長、胚芽長、子葉長及子葉寬，求其平均值。

1.4.4 十芽重 種子置床后第10天參試材料各處理每個重復隨機選取10株幼苗，用萬分之一天平稱量其芽鮮重，求其平均值[16]。

1.4.5 萌發指數、活力指數 萌發指數GI=∑(DG/DT)，DG為逐日發芽數，DT為DG對應的發芽天數(d)；活力指數VI=GI×最后1天測的胚根長[17]。

1.4.6 隸屬函數法對參試材料抗旱性評估 以抗旱相關生理及形態指標測定結果為依據，參照郝小琴等[18]的隸屬函數分析法對丹參5個栽培類型的抗旱相關指標的加權平均隸屬函數值進行計算，并分別綜合評價各品種的抗旱性。隸屬函數分析中涉及的相關參數的計算參照下式：

相對值(抗旱系數)=測定值/對照值

標準差系數：

權重系數：

2 結果與分析

2.1 丹參不同栽培類型各指標對PEG脅迫的響應

由表2可知，PEG模擬干旱脅迫處理后，不同栽培類型丹參萌發期的生長發育指標發生了一系列的變化。B和C的發芽率、發芽勢隨著脅迫濃度的增加表現為先升高后降低再升高的雙峰趨勢，而其他3個栽培類型的發芽勢均表現為隨PEG濃度增加呈先升高再降低趨勢，低濃度(3%PEG-6000)處理促進作用最大，高濃度(12% PEG-6000)產生抑制；A、E發芽率與其發芽勢變化趨勢相同，而D的發芽率則表現為隨著脅迫濃度增大而逐漸減小的趨勢。5個丹參栽培類型中D在PEG-6000濃度為0%、3%、6%時發芽率均高于相同濃度處理下的其他材料，最高可達56.5%，C、D和E在12% PEG-6000下發芽率最低，僅為0%。低濃度(3%PEG-6000)處理對丹參種子的發芽及生長發育具有促進作用，但濃度過高(12% PEG-6000)會抑制丹參種子的萌發。隨著干旱脅迫程度的增大，除D外其他栽培類型發芽勢、發芽率表現出先增大后減小的趨勢，5個丹參栽培類型中除E 外子葉長和子葉寬也均表現出先增大后減小的趨勢，除A和D外其他類型的十芽重、萌發指數和活力指數均表現出先增大后減小的趨勢。各類型材料不同的指標對干旱脅迫的反映表現趨勢不一致，敏感程度也不同，用單一指標值進行抗旱性評價雖然簡單易行但具有片面性，故需運用多個指標進行抗旱性綜合評價。

表2 不同干旱脅迫處理下丹參的主要形態指標Table 2 Main morphological growth indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

5個丹參栽培類型在PEG-6000溶液的濃度達到12%時，種子萌發受到明顯抑制，其中C、D、E種子沒有萌發。9% PEG-6000濃度比6% PEG-6000濃度對A、B、D和E的胚芽長、胚根長、子葉長、子葉寬的傷害率高，對A、D和E的萌發指數和活力指數傷害率也較高。因此，9% PEG-6000是較適宜的丹參種子萌發期抗旱性鑒定濃度。

2.2 利用主成分分析及相關性分析篩選抗旱鑒定指標

對9個指標的相對值(表3)進行主成分分析(表4)，結果表明，第1和第2主成分累積貢獻率達82.635%，表明前2個主成分概括了5個丹參栽培類型的9個指標82.635%的數據信息。因此，提取出前2個主成分。第1主成分中，發芽勢、胚芽長、子葉長、子葉寬、十芽重、活力指數有較大的特征向量；第2主成分中胚根長和萌發指數有較大的特征向量。綜合2個主成分所攜帶的信息，可選2個主成分中8個較大的特征向量：發芽勢、胚芽長、子葉長、子葉寬、十芽重、胚根長、活力指數和萌發指數來概括9個指標的大部分信息。然后對篩選出的8個綜合指標的相對值進行因子分析。結果表明，前兩個因子的特征根λ>1，能夠充分概括絕大多數數據。提取出前2個因子，將具有相同本質的變量歸為一類，把原來8個單項指標轉換為2個新的相互獨立的綜合指標(公因子)。根據公因子的載荷矩陣(表5)可以發現，第1個公因子F1中子葉長、子葉寬、十芽重有較大的載荷，可初步判斷第1個公因子反映的是丹參種子在PEG脅迫下子葉和胚芽的生長情況；第2個公因子F2中發芽勢、萌發指數、活力指數有較大的載荷，進一步說明在PEG脅迫下，發芽相關指標是比較明顯的抗旱指標。因此根據2個公因子的載荷，可將子葉長、子葉寬、十芽重等劃為抗旱性主要鑒定指標，發芽勢、萌發指數、活力指數等劃為重要指標。

表3 不同干旱脅迫處理下丹參主要形態指標相對值Table 3 Relative values of main morphological indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

表4 主成分分析結果Table 4 Results of principal components analysis

表5 各指標因子載荷、特征根和貢獻率Table 5 Factor loading, characteristic root, and contribution rate of each comprehensive index

2.3 利用隸屬函數分析鑒定抗旱性

為了消除遺傳背景差異和單個指標研究的局限性，本研究對9% PEG-6000脅迫下各抗旱指標相對值的隸屬函數值與加權平均隸屬函數值進行綜合性分析。由表6可知，所測9個指標的相對值變異系數變幅為64.01%～134.39%，說明本研究選用的丹參材料類型豐富，具有較好的代表性。以標準差系數賦予權重，求得各項指標的隸屬函數值和綜合隸屬函數值(D值)，綜合值越大, 說明該栽培類型的抗旱性就越強，反之越弱。根據綜合隸屬函數值可得出丹參抗旱性強弱依次為E、C、B、D、A，其綜合隸屬函數值分別為：0.071、0.068、0.054、0.043、0.028，說明E和C抗旱能力相對較強，A的抗旱能力相對較弱。

3 討 論

萌發期是植物生長發育的起始階段，植物在這一時期最容易受到各種逆境脅迫，逆境脅迫通過影響出苗率和成苗率決定了全田基本苗數，最終影響產量構成。所以在萌發期鑒定品種抗旱性對干旱地區的農業生產具有重要意義。植物抗旱性鑒定一般采用土壤干旱和高滲溶液模擬干旱2種方法，其中聚乙二醇高滲溶液模擬干旱脅迫的方法簡單、可重復、穩定，適合在萌發期快速鑒定大量品種(系)的抗旱性，目前已成為對很多植物種子在萌發期進行抗旱性研究的重要手段。本研究采用5個濃度的PEG-6000溶液對丹參萌發期抗旱性進行分析，根據發芽率和對各種指標的傷害率情況將9%作為丹參萌發期抗旱性鑒定的適宜PEG濃度。研究發現，高濃度PEG對種子萌發產生明顯的抑制作用，且各指標對滲透脅迫的響應并不一致，這與安永平等[19]、趙海明等[20]、王贊等[21]、鞠樂等[11]的研究一致。12% PEG-6000下C、D和E種子發芽率為0，可能是因為丹參種子在萌發初期會快速吸水以保證萌發所需水分，過高的滲透脅迫抑制種子吸水，從而導致其無法萌發。低濃度的PEG脅迫(3%或6%)促進部分栽培類型丹參種子的萌發及胚根、胚芽、子葉生長，這與趙方媛等[22]低濃度(10%，20%)PEG-6000有利于小黑麥種子萌發，并對幼苗根與胚芽的生長有一定促進作用的研究一致，與王濤等[23]低濃度的PEG處理有利于促進丹參種子萌發和保證出苗的研究結論一致。據表6 各指標在9% PEG-6000的隸屬函數值的變異系數大小可知，發芽勢、子葉長、子葉寬的變異系數分別為134.39%、117.46%和133.03%，說明這3個指標對干旱脅迫反應較敏感。

表6 9% PEG-6000濃度時各抗旱相關指標隸屬函數值Table 6 Membership function values of drought resistance indexes at 9% PEG-6000

鑒定作物的抗旱性除了選擇合適的評價指標外，還有要有適宜的鑒定方法。隸屬函數法既能消除個別指標鑒定帶來的片面性，又可使所有供試材料抗旱性具有可比性。主成分分析則可以在保證原有信息不損失的前提下，將復雜的多個單項指標轉化為幾個綜合指標。近年來主成分分析聯合隸屬函數法等多方法多指標相結合手段已在胡麻[24]、酒用糯高粱[25]、谷子[26]、棉花[27]等作物抗旱性鑒定中廣泛運用。本研究利用主成分分析法將9個單項指標轉化成2個主成分，選取其中特征向量較大的8個指標，進一步進行因子分析，選擇在2個公因子上有較大載荷的6個相關指標作為抗旱鑒定指標。由于各指標之間所用單位不同，因此結合加權隸屬函數法消除不同指標間單位的差異，最后根據綜合隸屬函數值得出供試5個丹參材料的抗旱性強弱順序，篩選出抗旱性較強的種質E。張樹林等[28]認為萌發期抗旱性鑒定的關鍵指標分別是芽長、發芽勢和根鮮重。張立坤等[29]運用主成分分析法結合綜合隸屬函數法評價了燕麥的抗旱性，篩選出萌發指數、發芽指數、活力指數、鮮重、胚芽長、胚根長和發芽勢等抗旱鑒定指標。不同試驗篩選出的抗旱鑒定指標不同可能是因為研究材料不同。因此，依據生產實際需求，針對不同藥用植物開展種子萌發期干旱脅迫的耐旱試驗，篩選耐旱材料，對指導中藥材生產和選育耐旱品種意義重大。

4 結 論

本試驗采用隸屬函數法結合主成分分析法的抗旱性綜合評價方法對5個丹參栽培類型萌發期的抗旱性進行了綜合性評價。確定了9% PEG-6000為丹參種子萌發期抗旱性評價的適宜濃度，以綜合隸屬函數值為評價指標得出5個丹參栽培類型的抗旱性為：豫丹參VE>豫丹參VC>豫丹參VB>豫丹參VD>豫丹參VA，其中豫丹參VE和豫丹參VC萌發期抗旱能力較強，可作為丹參抗旱育種和抗旱機理研究的優異種質。通過主成分分析和相關性分析篩選出了子葉長、子葉寬、十芽重、發芽勢、萌發指數和活力指數作為丹參萌發期抗旱快速鑒定指標。