基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討土荊皮治療淺部真菌病的作用機(jī)制

袁芳草，吳 然，李 倩，張丹林，彭 超，唐姍姍

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽 550001）

淺部真菌病（Superficial mycosis）是一種真菌疾病，其病灶主要局限于皮膚、指甲或頭發(fā)的外層，但可能會侵入更深層的組織[1]。此病由皮膚癬菌、霉菌、酵母菌和酵母樣真菌引起，會對患者的心理和社會心理因素產(chǎn)生負(fù)面影響，并降低其生活質(zhì)量，是全世界重點(diǎn)關(guān)注的健康問題[2]。目前由于抗真菌藥物在淺部真菌病治療中的廣泛應(yīng)用，有關(guān)抗真菌藥物耐藥性的報(bào)道不斷增加，抗真菌藥物耐藥性的增加正在成為一個公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[3]。中醫(yī)藥治療淺部真菌病歷史悠久，中藥外治淺部真菌病的療效可與西醫(yī)抗真菌藥媲美，且具有不良反應(yīng)少和復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢[4]。土荊皮（Pseudolarix kamepferi）又名土槿皮，為我國特有松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮，始載于趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，具有殺蟲止癢、祛風(fēng)除濕的功效[5]。土荊皮的多種化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗血管生成、抗真菌等活性[6]，其中抗真菌活性應(yīng)用前景廣闊，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)對土荊皮治療淺部真菌病的效果進(jìn)行研究，旨在為淺部真菌病的中藥治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種和藥物

紅色毛癬菌由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科饋贈；土荊皮飲片購自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.2 試劑和儀器

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；氯霉素購自北京索萊寶科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱（美國致微ZWALWAY 產(chǎn)品）；顯微鏡（瑞士TECAN 公司產(chǎn)品）；麥?zhǔn)媳葷醿x（北京海富達(dá)科技有限公司產(chǎn)品）；玻璃冷凝管回流裝置（山東禹王公司產(chǎn)品）；真空干燥箱（天津鑫州儀器有限公司產(chǎn)品）。

1.3 土荊皮成分和靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺輸入土荊皮作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將OB 值≥30% 和DL 值≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將篩選出的有效成分上傳至PubChem 數(shù)據(jù)庫中得到對應(yīng)的SMILES 號，隨后通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，將得出的所有靶點(diǎn)進(jìn)行去重整理，并通過Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)

將Superficial mycosis 作 為 關(guān) 鍵 詞，通 過GeneCards 疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，即得出淺部真菌病的靶點(diǎn)。將得出的土荊皮靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，得出的靶點(diǎn)為土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)

將得到的土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫中，將其生物物種設(shè)置為H.sapiens，根據(jù)所需要求導(dǎo)出TSV 格式上傳至Cytoscape 軟件對得出的結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析，并設(shè)置物種選項(xiàng)為H.sapiens 和P＜0.01，并 通 過Cytoscape 軟 件 構(gòu)建出成分- 通路- 靶點(diǎn)圖。

1.7 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌實(shí)驗(yàn)研究

1.7.1 藥物提取 先將土荊皮粉碎成粗粉，并置于無水乙醇中浸泡5 ～6h（無水乙醇：藥材為10：1），通過回流冷凝法提取1h，并用絹布過濾，得出藥液。再向藥渣中加入8 ～10 倍體積的無水乙醇，浸泡、加熱回流提取并過濾。將得到的兩次乙醇液混合，加熱過濾，并進(jìn)行減壓干燥。置于-20℃環(huán)境中冷凍至少24h，然后通過進(jìn)行真空冷凍干燥得出提取物。

1.7.2 藥敏實(shí)驗(yàn) 取PDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，高溫高壓滅菌，備用。將封存的紅色毛癬菌菌種接種于制備好的PDA 培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用棉拭子蘸取活化后的菌種溶于3mL 的生理鹽水中，用比濁儀將濃度調(diào)至0.5 麥?zhǔn)希?×106～6×106cfu/mL），再用生理鹽水稀釋至1×103～6×103cfu/mL，備用。取SDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，滅菌后制含藥培養(yǎng)基備用。將1g土荊皮醇提物用1mL 無水乙醇和9mL 生理鹽水進(jìn)行溶解，取2mL 藥液用二倍稀釋法分別稀釋為50 mg/mL至0.097 mg/mL 共10 個濃度。分別加入12 孔板中，隨后各孔均加入100μL 濃度為1×103～6×103cfu/mL的菌液。陽性對照組加菌液不加藥液，空白對照組不加菌液和藥液，最后在各孔加入1mL 的SDA 培養(yǎng)基。于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7d，當(dāng)陽性對照組生長出菌絲時，肉眼觀察加藥組沒有菌落生長的最低藥物濃度為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 土荊皮的有效成分及靶點(diǎn)的預(yù)測

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出OB 值≥30%、DL值≥0.18 的有效成分共8 種，由于土荊皮丙酸無對應(yīng)靶點(diǎn)，最終符合要求的成分為7 種，見表1。采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測以上7 種有效成分的藥物靶點(diǎn)，對其整理后去重得出土荊皮的109 個靶點(diǎn)，上傳至Cytoscape 軟件構(gòu)建出成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

圖1 成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 土荊皮的有效成分

2.2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點(diǎn)獲取和PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得淺部真菌病的靶點(diǎn)421 個，將土荊皮和疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理得出治療的有效靶點(diǎn)共17 個。將土荊皮治療淺部真菌病的17 個靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫中，得出的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含17 個節(jié)點(diǎn)、39 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.59。導(dǎo)入Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化，見圖2。圖中可見IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點(diǎn)PPI 分析

2.3 GO 分析和KEGG 分析

將土荊皮治療淺部真菌病的17 個治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析。GO分析的結(jié)果顯示，治療靶點(diǎn)主要與缺氧反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-6 產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等相關(guān)。KEGG 通路分析得出的通路為癌癥的途徑、CLRs 信號通路、恰加斯病、Th17細(xì)胞分化。將相關(guān)的藥物成分和靶點(diǎn)上傳至Cytoscape中進(jìn)行可視化分析，得出成分—靶點(diǎn)—通路圖，見圖3。

圖3 土荊皮治療淺部真菌病的“成分—靶點(diǎn)—通路”圖

2.4 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌實(shí)驗(yàn)研究

在12 孔板的1 ～10 號孔中分別加入10 個濃度的土荊皮醇提物，并設(shè)置空白對照組（-）和陽性對照組（+）。將12 孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)觀察至第7d 后，結(jié)果顯示土荊皮醇提物對紅色毛癬菌有明顯抑制作用，最小抑菌濃度（MIC）為1.562 mg/mL，見表2、圖4。

表2 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌作用

圖4 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌抑制作用的鏡下觀察

3 討論

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出土荊皮的主要成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。樺木酸作為一種三萜類化合物，在濃度為8 ～128μg/mL 的范圍內(nèi)可達(dá)到殺滅真菌的效果。樺木酸的哌嗪基衍生物表現(xiàn)出與特比萘芬相似的抗真菌譜，并且是抗皮膚真菌最有效的衍生物[7]。有研究發(fā)現(xiàn)β- 谷甾醇是一種具有廣泛抗真菌活性的植物代謝產(chǎn)物，可通過結(jié)合Osh4蛋白達(dá)到抗真菌的效果[8]。國外研究表明芒柄花黃素對白色念珠菌、新生隱球菌、熱帶念珠菌等真菌都表現(xiàn)出良好的抗真菌活性，MIC 值為25 μg/mL[9]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明，由皮膚癬菌、足馬杜拉分枝菌等真菌感染引起的淺部真菌病患者的血清中，細(xì)胞因子IL-2、IL-4 的表達(dá)水平明顯提升。另有動物實(shí)驗(yàn)表明，由須癬毛癬菌建立的動物淺部真菌感染模型中，血清中IL-2、IL-6 的水平明顯升高[10]。HSP90 類蛋白在病原菌的生長、毒力以及藥物耐藥性等方面具有多重調(diào)控作用，靶向HSP90 在抗真菌治療中有著巨大的潛力，研發(fā)選擇性作用于真菌HSP90 的治療藥物具有廣闊的前景[11]。田珂[12]通過臨床觀察得出，紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者外周血血清中NO 及NOS 的表達(dá)下降，這可能是導(dǎo)致感染易反復(fù)的原因之一。GO 分析顯示土荊皮主要通過缺氧反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-6 產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)等途徑對淺部真菌病產(chǎn)生作用。KEGG 分析得出土荊皮治療淺部真菌病的通路主要為癌癥的途徑、CLRs 信號通路、Th17 細(xì)胞分化等。目前有研究發(fā)現(xiàn)癌癥與真菌感染有著密切的聯(lián)系，白色念珠菌引起的感染能夠通過產(chǎn)生致癌副產(chǎn)物、引發(fā)炎癥、誘導(dǎo)Th17 反應(yīng)等促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[13]；而且，癌癥病人的免疫力低下，更易出現(xiàn)淺部真菌感染。CLRs 信號通路與淺部真菌病聯(lián)系密切，在真菌感染期間，CLRs 和Toll 樣受體(TLR)可通過識別各種真菌表面成分在宿主防御真菌病原體中發(fā)揮重要作用[14]。Th17 途徑的一些關(guān)鍵要素可被皮膚癬菌激活，如Th17 途徑的刺激可以通過抗原呈遞細(xì)胞中一些CLRs 受體和炎癥小體的激活而發(fā)生，進(jìn)而參與皮膚癬菌免疫反應(yīng)[15]。另有臨床研究表明，真菌感染患者會出現(xiàn)Th17、Th17/Treg 水平的明顯降低，Th17/Treg 免疫失衡是真菌入侵機(jī)體的重要途徑[16]。紅色毛癬菌是誘發(fā)淺部真菌病的主要病原體之一，本次體外抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示土荊皮的醇提物對紅色毛癬菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度為1.562 mg/mL。有研究指出，土荊皮醇提物可通過抑制菌絲及孢子生長或破壞菌絲形態(tài)來抑制紅色毛癬菌的活性。近年來，中藥抗真菌作用是臨床研究的熱點(diǎn)。高璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)，知母水提物對紅色毛癬菌有著明顯的抑制效果。劉登宇等[18]發(fā)現(xiàn)，白鮮堿對紅色毛癬菌的抑菌機(jī)制可能與抑制細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、降低耐藥性等途徑有關(guān)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)土荊皮治療淺部真菌病的主要起效成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。此藥通過作用于IL2、HSP90AA1、NOS2等靶點(diǎn)以及對CLRs 信號通路、Th17 細(xì)胞分化等通路的調(diào)節(jié)來發(fā)揮對淺部真菌病的治療作用。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明土荊皮對紅色毛癬菌有著明顯的抑制作用，其機(jī)制與抑制菌絲及孢子生長相關(guān)。本研究為治療淺部真菌病提供了新的思路和方向，同時也為土荊皮的開發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。