油茶葉斑病病原菌的分離、鑒定與室內(nèi)毒力測定

廖 凱，郝亞倫，金晨鐘,2，郭開發(fā),2，郭 軍,2，陳 苗

（1.湖南人文科技學院農(nóng)田雜草防控技術與應用協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)藥無害化應用湖南省高校重點實驗室，湖南 婁底 417000；2.婁底市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南 婁底 417000）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）以其茶油、茶籽、茶殼、茶葉、茶根等保健功效而著稱[1]，其中茶油對心腦血管、高血壓、高血脂有一定的抑制作用[2]。目前全國油茶種植面積達453.3 萬hm2，湖南油茶種植面積、茶油產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國第一[3]。然而油茶在栽培生產(chǎn)中，隨著種植面積的不斷增加，種植品種不斷增多，油茶葉斑病[4]和炭疽病[5]發(fā)生越來越嚴重。油茶葉斑病主要危害葉片，病斑由小到大呈不規(guī)則狀，紅褐色至灰褐色，病健界限明顯，病斑處凹陷，病葉常提早脫落，新梢出現(xiàn)枯死現(xiàn)象，導致油茶產(chǎn)量大幅下降。前人對油茶葉斑病的病原菌進行分離鑒定，有的鑒定為擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis kenyana）[6]，有的鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）[4,7]。筆者從雙峰縣油茶基地采集了7 份油茶葉斑病病葉樣本，采用組織分離法從中分離純化獲得3 株病原菌，進行形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定及致病性檢測，旨在明確油茶葉斑病的病原菌種類，并通過帶毒介質(zhì)菌絲生長速率法測定該病原真菌對6 種藥劑的敏感性，為油茶葉斑病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021 年4 月在湖南婁底市雙峰縣洪山殿鎮(zhèn)油茶基地采集油茶葉斑病樣品，共采集樣品7 份。病斑近圓形，紅褐色至灰褐色，病健界限明顯，病斑處凹陷。將采集的病葉用封口袋裝好帶回實驗室進行分離培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化采用組織分離法[8]取典型葉斑病葉片用75%乙醇擦拭表面并風干，于病健交界處切下5 mm×5 mm 小塊，在超凈工作臺用1%次氯酸鈉消毒1 min，用無菌水沖洗3 次后，用濾紙吸干表面水分，接種到PDA 平板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d 后，在WA 平板上進行單孢純化，將純化后獲得的菌株保存在PDA 斜面上，置4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學特征觀察將病原菌用PDA 培養(yǎng)基在25℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d，采用壓片法，對菌落形態(tài)、色澤、大小分生孢子的特征進行觀察，測量分生孢子的大小等。參照張?zhí)煊頪9]的方法在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗及喙狀細胞的形態(tài)，并觀察成鏈情況。

1.2.3 分子鑒定依據(jù)形態(tài)學鑒定結(jié)果，挑選代表菌株在PDA 平板上培養(yǎng)5 d 后，采用DNA 提取試劑盒提取病原物的DNA，采用引物ITS1/ITS4[10]和EF1-983F/EF1-728[11]進行PCR 擴增。PCR 反應體系（50 μL）：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）25 μL，ITS1/EF1-983F 2 μL、ITS4/EF1-728F 2 μL、DNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。ITS基因序列PCR擴增反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 個循環(huán)；72℃延 伸10 min。EF1-α基 因 序 列PCR 反 應 程 序 為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 反應產(chǎn)物。將不同引物的 PCR 反應產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序后的基因序列經(jīng)校正后，在GenBank 中進行同源序列搜索（BLAST），比較供試菌株與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應序列的同源程度。利用MEGA 5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.2.4 致病性測定采用菌餅貼接法[12]測定病原菌的致病性。采集健康油茶葉片用75%酒精進行表面消毒，用滅菌的打孔器（φ=5 mm）在培養(yǎng)菌落打取菌餅，將打好的菌餅貼接在油茶葉片處，以不接種病原菌的PDA 培養(yǎng)基菌餅作為空白對照接種健康油茶葉片，每個處理重復5 次。將接種好的油茶放在鋪有濕潤滅菌濾紙的保鮮盒中，葉柄處用無菌濕潤的脫脂棉包裹，置于人工光照氣候箱中培養(yǎng)。每天觀察病斑生長情況，5 d 后量取病斑直徑，進行拍照記錄。

1.2.5 病原菌室內(nèi)毒力測定采用菌絲生長速率法進行殺菌劑室內(nèi)毒力測定。供試殺菌劑為5%己唑醇懸浮劑、45%咪鮮胺水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、43%戊唑醇懸浮劑和75%百菌清可濕性粉劑。在預試驗的基礎上，將6 種藥劑原藥各設置成5 個對應濃度梯度（500 倍、1 000 倍、2 000 倍、4 000 倍、8 000 倍），分別吸取不同濃度的化學藥劑滴入PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，混勻，冷卻凝固備用，每個濃度梯度3 個重復。以加入等量無菌水的PDA 平板為對照。用滅菌的打孔器（φ=5 mm）打取培養(yǎng)好的病原菌菌餅 1塊，接種到上述PDA 平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，求出毒力回歸方程，進一步算出 EC50值及相關系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

從采集的7 份油茶葉斑病中分離得到3 株分離物，分離物菌落為圓形灰褐色或灰綠色，邊緣整齊，菌落背面灰褐色（圖1A、B）；菌絲大多數(shù)呈卷曲交織的絨毛狀，氣生菌絲發(fā)達致密，生長迅速，5 d后菌落直徑達8.5 cm，長滿整個培養(yǎng)基；分生孢子黃褐色或褐色，長橢圓形、卵形、棍棒狀或倒梨形（圖1C），磚隔孢，橫隔膜1～6 個，豎或斜隔膜0～3個，孢子長4.0～61.5 μm，寬3.8～25.4 μm，有的孢子有2.0～16.0 μm 假喙（圖1D）。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定為鏈格孢屬。

圖1 分離所得病原菌的形態(tài)特征

2.2 分子生物學鑒定

利用ITS基因序列對該病原菌進行PCR 擴增，經(jīng)電泳檢測分別獲得大小約為500、250 bp 的清晰條帶，然后將測得的序列登錄NCBI 進行BLAST 比對，3 株病原菌的28S rRNAITS序列（登錄號分別為MZ664270.1，MZ664271.0，MZ664272.1）與已登錄的Alternaria alternata菌株（登錄號依次為KP900243.1、MZ160955.1）相似性達99.63%以上。采用MEGA7進行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過自展法（bootstrap）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），YCB 菌株與Alternaria alternata菌株處于同一個分支上，相似性較高。最終，結(jié)合形態(tài)學特征、28S rRNAITS序列分析，確定引起油茶葉斑病的病原物為Alternaria alternate。

圖2 各代表菌株基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 致病性測定

將分離所得病原菌離體接種到健康油茶葉片上，接種5 d 后，接種部位出現(xiàn)灰白色水漬狀病斑，接種10 d 后，接種部位中間為灰白色，邊緣為黑褐色病斑，試驗接種癥狀與田間癥狀一致，空白處理未發(fā)病（圖3）。而且從發(fā)病病斑上可重新分離到相同的病原菌。

圖3 病原菌對健康油茶葉片的致病性測定

2.4 病原菌室內(nèi)毒力測定

由表1 可知，6 種化學藥劑的EC50值由大到小排列依次為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑＞75%百菌清可濕性粉劑＞5%己唑醇懸浮劑＞43%戊唑醇懸浮劑＞10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑＞45%咪鮮胺水乳劑，油茶葉斑病菌對后4 種化學藥劑表現(xiàn)敏感，其中油茶葉斑病菌對藥劑45%咪鮮胺水乳劑最為敏感，其EC50值為0.521 5 mg/L，對藥劑70%甲基硫菌靈可濕性粉劑最不敏感，其EC50值為9 021.94 mg/L。

表1 供試殺菌劑對油茶葉斑病病菌的毒力回歸方程和EC50值

3 結(jié)論與討論

已有文獻報道，引起油茶葉部病害的病原菌有Lasiodiplodia theobromae[13]、Nigrospora sphaerica[14]、Colletotrichum gloeosporioides[15]、Colletotrichum henanense[16]。特別是炭疽菌屬Colletotrichum真菌危害林木、果樹、蔬菜、花卉、藥用植物和大田作物的根、莖、葉、花、果實和幼苗，可導致植株枯萎、果實腐爛、葉片病斑等癥狀，造成嚴重經(jīng)濟損失[17-18]。為了明確湖南丘陵地區(qū)油茶葉斑病的病原菌種類，研究在雙峰縣洪山殿鎮(zhèn)油茶基地采集了7 份油茶葉斑病樣品，采用組織分離法從中分離、純化獲得3株病原菌，通過形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定及致病性檢測，證實該病原菌與交鏈格孢Alternaria alternata基本一致，擴增得到的rDNA-ITS基因序列與交鏈格孢Alternaria alternata序列的同源性高達99.63%；在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，該病原菌也與交鏈格孢Alternaria alternata聚在同一個分支上，結(jié)合致病性測定試驗，可將該病原物鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。

鏈格孢菌屬菌株大多數(shù)兼性寄生在植物（農(nóng)作物、經(jīng)濟作物和果樹林木等）上，可占領其他病原物造成的病斑位點、受損部位或其他衰弱組織等，加重其他病害的發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失[19]。鏈格孢屬下種類多，屬級特征醒目而種級特征變異較大，單純根據(jù)形態(tài)特征進行種類鑒定和區(qū)分難度較大，甚至存在爭議，因此結(jié)合分子生物學手段進行種類鑒定可使鑒定結(jié)果更為可靠。

為有效防治油茶葉斑病，該研究還進行了病原菌室內(nèi)毒力測定試驗。結(jié)果表明，5%己唑醇懸浮劑、45%咪鮮胺水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、43%戊唑醇懸浮劑4 種藥劑對油茶葉斑病病原菌具有不同程度的抑菌效果，可用于油茶葉斑病的化學防治。其中，油茶葉斑病菌對藥劑45%咪鮮胺水乳劑最為敏感，其EC50值為0.521 5 mg/L；對藥劑70%甲基硫菌靈可濕性粉劑最不敏感，其EC50值為9 021.94mg/L。