八寶景天總黃酮的提取純化及抗氧化抑菌活性的研究進(jìn)展

鄭樂樂，錢義慧，馬麗君，張雙雙，李 娜

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

八寶景天（Hylotelephium erythrostictum），別名蝎子草、長(zhǎng)藥景天、華麗景天，是一種可以為藥用的、名為八寶的草藥。又名“八寶”“胡豆七”“活血三七”等，屬于景天科八寶屬的草本植物，其葉子肥大，根莖粗壯，根莖、葉子及花朵都可以入藥，并且一年四季都可以隨時(shí)采摘，但更多的人喜歡用新鮮的八寶景天來(lái)入藥。八寶景天在《海藥本草》 《開寶本草》 《本草綱目》等中醫(yī)學(xué)典籍中均有記載，在東北、河北、湖北、江蘇、浙江、安徽、河南、四川、貴州、云南、山西等地都有大量栽種，而且生長(zhǎng)狀況良好，是一種極易栽培、生長(zhǎng)范圍很廣的植物。八寶景天無(wú)論在生物學(xué)上還是在化學(xué)上，其性質(zhì)均很穩(wěn)定、口感較為苦澀，并帶有略微的酸味。此外，八寶景天還有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、促進(jìn)皮膚血液循環(huán)、止痛止血的作用。經(jīng)過(guò)對(duì)八寶景天深入研究，發(fā)現(xiàn)其及其提取物中含有非常復(fù)雜、豐富且多元化的生物功能性物質(zhì)，其中包括各種天然活性生物堿、甾體、鞣質(zhì)、黃酮類化合物及其衍生物、縮合單寧和生氰化合物等，使得黃酮類化合物在醫(yī)療應(yīng)用方面的成效非常顯著。

黃酮類化合物（Flavonoids 或flavonoes compounds） 是指基本母核為2- 苯基色原酮的類化合物，具有一個(gè)由中間的吡喃或吡喃酮環(huán)（C） 連接的2 個(gè)苯環(huán)（A 和B） 的三環(huán)核心，是一大類的次生代謝產(chǎn)物，在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中所形成，在植物群落中有大量的存在。目前，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了近萬(wàn)種植物中含有類黃酮類成分，并且類黃酮的種類已經(jīng)超過(guò)了5 000 種，其中最為常見的是：二氫黃酮及二氫黃酮醇類、異黃酮和黃酮醇類、黃烷醇類、花色素類、雙黃酮類、查耳酮類及其他黃酮類。雖然大多數(shù)的類黃酮都可以與糖基化合成糖苷，但是也有一些是以游離狀態(tài)存在。黃酮類化合物的藥理作用多種多樣，已被大量的試驗(yàn)研究證實(shí)，其藥理作用有抗氧化、消炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、抗抑郁、抗心腦血管疾病、抗糖尿病及其并發(fā)癥、調(diào)血脂及提高免疫力等。

八寶景天作為一種觀賞性植物，在園林綠化中得到了廣泛的應(yīng)用，然而關(guān)于八寶景天更高的藥用價(jià)值，特別是其黃酮類物質(zhì)的有效提取、分離、純化及其抗氧化、抑菌作用的深入研究寥寥無(wú)幾。現(xiàn)綜述八寶景天總黃酮的提取工藝、總黃酮經(jīng)大孔樹脂純化的最優(yōu)分離條件，以及八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌作用的生物活性。

1 總黃酮的提取

1.1 超聲提取法

超聲波萃取是一種有效成分的提取方法，在中藥活性成分的提取中被廣泛應(yīng)用。超聲提取技術(shù)是將高能超聲注入到提取體系中，使體系內(nèi)形成無(wú)數(shù)個(gè)小孔并快速閉合，當(dāng)小孔閉合時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生瞬間高壓，推動(dòng)超聲提取加快提取速度。通過(guò)介質(zhì)吸收超聲波并產(chǎn)生內(nèi)摩擦，使其產(chǎn)生強(qiáng)烈的振動(dòng)，通過(guò)這個(gè)過(guò)程，使超聲振動(dòng)的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為介質(zhì)內(nèi)能。同時(shí)，介質(zhì)的溫度和植物天然產(chǎn)物組織的內(nèi)部溫度也會(huì)逐步升高，導(dǎo)致2 種壓力均可引起試樣表面的變形和破壞。此外，溶劑和樣品粒子之間存在不同的加速度，二者之間產(chǎn)生的摩擦?xí)?dǎo)致2 個(gè)碳原子之間的碳碳雙鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致聚合物的裂解。超聲提取對(duì)象物質(zhì)的方法主要有3 種機(jī)理，即熱空化學(xué)作用、熱作用和機(jī)械作用，這3 種機(jī)理被廣泛應(yīng)用于超聲提取技術(shù)中。將超聲波萃取技術(shù)應(yīng)用于植物活性成分的提取過(guò)程中，不僅能節(jié)省能源，還能有效地提高提取效果。

1.2 酶解法

一些特定的酶類可以在一定程度上促進(jìn)某些特定的化學(xué)反應(yīng)，使其具有較高的反應(yīng)效率和較高的產(chǎn)物活性。酶解法是將蛋白質(zhì)的肽鍵或胺鍵進(jìn)行特定的水解，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后，其極性基團(tuán)數(shù)目增加，肽鏈長(zhǎng)度變短，肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量下降，使蛋白質(zhì)的溶解性增強(qiáng)，功能形狀也會(huì)隨之變化，細(xì)胞壁或者蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)合物被破壞，目標(biāo)產(chǎn)物——總黃酮類化合物被釋放。由于植物細(xì)胞壁主要由一種可溶于水的纖維素構(gòu)成，且含有少量的果膠，因此在大量的試驗(yàn)中，人們常采用木質(zhì)素（Lignose） 抑制劑或多聚果膠酶（Polypectinase） 抑制劑，將細(xì)胞壁組分直接氧化降解，以獲得細(xì)胞膜包裹的胞漿系統(tǒng)物質(zhì)。破壁后，對(duì)提取活性物質(zhì)和有機(jī)溶劑的萃取具有極大的促進(jìn)作用。

1.3 酶法輔助超聲提取

通常用于試驗(yàn)研究的萃取法，其具有簡(jiǎn)便、快速和安全等特點(diǎn)，然而任何方法都具有兩面性，該方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低等問(wèn)題。針對(duì)這一問(wèn)題，擬以八寶景天為對(duì)象，利用適宜的酶和適宜的超聲能量，在有機(jī)溶劑中高效提取其有效成分。利用響應(yīng)曲面（Box-behnken） 法建立酶輔助超聲波的優(yōu)化模型，確定酶輔助超聲波的最優(yōu)條件，實(shí)現(xiàn)快速、溫和的提取。在Box-behnken 模型中，能夠更清楚地看到每個(gè)因素對(duì)反應(yīng)值的影響，為八寶景天中總黃酮的深層次開發(fā)利用提供參考。

呂凱波等人[1]在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)酶輔助超聲波法的最佳條件為超聲功率100 W，料液比1∶17（g∶mL），超聲處理時(shí)間32 min，纖維素酶添加量約為2.6%，超聲酶解持續(xù)時(shí)間49 min，試驗(yàn)證明，該方法提取的總黃酮含量可達(dá)14.01%，該方法提取的活性成分具有（89.9±0.06） %的抗·OH 能力，研究發(fā)現(xiàn)，與水煎法、回流法、酶法、超聲波法等相比較，酶輔助超聲波法在提取液中的活性成分含量要高出10%以上，超聲波與酶法結(jié)合提取的活性物質(zhì)表現(xiàn)出了較好的抗氧化性，該活性物質(zhì)的DPPH·、·OH 清除率都可提高20%以上。唐文文等人[2]利用超聲波乳化結(jié)合雙酶（纖維素酶、果膠酶） 快速高效地提取了當(dāng)歸表層部位中的總黃酮，最佳的提取工藝為酒精體積分?jǐn)?shù)小于50%，料液比大于50∶1，超聲波提取時(shí)間大于41 min，雙酶量地濃度比（纖維素酶∶果膠酶= 2∶1） ＞0.68 g/L，酶的完全水解所需地超聲波時(shí)間大約是93 min，在以上5 個(gè)最基本的水解條件下，從當(dāng)歸地表部位中提取的總黃酮的提取率達(dá)到了8.18%。孟永海等人[3]利用單因素試驗(yàn)，對(duì)乙醇萃取主要藥物所使用酶的含量百分?jǐn)?shù)及主要藥物用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶液pH 值、料液分配體積比、萃取溫度及時(shí)間、超聲溫度、時(shí)間及功率等進(jìn)行了研究，并對(duì)萃取方法的影響進(jìn)行了探討；以上述結(jié)果為依據(jù)，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)酶法輔助超聲法提取刺玫果實(shí)中總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到了總黃銅的最佳提取方案為纖維素酶用量15 mg/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，溶液pH 值5，藥物∶乙醇= 1∶15（g∶mL），提取溫度50 ℃，提取時(shí)間2.0 h，超聲提取輔助加熱功率為450 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min，刺玫果實(shí)提取物中的總黃酮提取率為128.6 mg/g。

2 黃酮類化合物的分離純化

采用酶輔助超聲波萃取的粗提物，其組分非常復(fù)雜，可能會(huì)影響后續(xù)八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌活性研究。另外，粗提物中總黃酮的相對(duì)含量偏低，不能滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。因此，需對(duì)粗提物進(jìn)行提純處理。為了得到較高的純度，在分離純化過(guò)程中，一般都會(huì)使用大孔樹脂吸附的方法以得到更高純度的提取液。

大孔樹脂吸附法與其他吸附法相比，大孔樹脂的吸附提純能夠在每單位質(zhì)量的物質(zhì)上提供更大的總面積（比表面積），并具有更大的吸附容量、更好的選擇性、更快的吸附速度等諸多優(yōu)點(diǎn)。大孔吸附樹脂是一類具有高選擇性、高穩(wěn)定性的固體分離材料。大孔樹脂特殊的三維立體多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，增大了分粗提取液與大孔吸附樹脂之間的接觸面積，使其具有更大的范德華引力，并可形成更多的氫鍵作用，這樣可以將來(lái)自極低濃度溶液的目標(biāo)有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行吸附。由于大孔樹脂在3D 空間中具有不同尺寸的立構(gòu)孔道，使其在溶液流經(jīng)大孔樹脂時(shí)，不同分子在孔道中的穿透力存在較大差異，進(jìn)而影響其對(duì)溶液的吸附速度。在利用大孔樹脂對(duì)粗提取液純化的過(guò)程中，可以將具有不同吸附力和不同分子量尺寸的有機(jī)化合物吸附在樹脂上，然后用不同的溶劑洗脫，從而實(shí)現(xiàn)精細(xì)的分離和提純[18]。

2.1 大孔樹脂的分類及常見型號(hào)

將大孔樹脂按照其極性大小及所選擇的小分子與分子間以共價(jià)鍵結(jié)合形成聚合物的小分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別，將其劃分為三大類：非極性大孔吸附樹脂、極性大孔吸附樹脂，以及中極性大孔吸附樹脂[19]。大孔樹脂的種類繁多，而且每一種樹脂的型號(hào)都不一樣，不同類型和型號(hào)的大孔樹脂，其吸附特性也會(huì)有很大的差異。目前，我國(guó)有南開大學(xué)化學(xué)研究所生產(chǎn)的AB、D、H 系列，上海制藥研究所生產(chǎn)的SIP系列等。

2.1.1 非極性大孔樹脂

非極性大孔吸附樹脂又被稱為芳香性吸附劑，如苯乙烯，二乙烯苯等，有很小的轉(zhuǎn)矩用來(lái)收集單倍體。由于其主鏈結(jié)構(gòu)中不含有任何功能性堿基，因此非極性大孔樹脂表面具有較強(qiáng)的疏水性，但對(duì)有機(jī)溶劑中的疏水性組分具有較強(qiáng)的吸附能力。最適宜的是在極性溶劑中對(duì)非極性物質(zhì)（如水） 進(jìn)行吸附，而在極性溶劑中對(duì)小分子的疏水性部分則會(huì)產(chǎn)生分子作用。在實(shí)驗(yàn)室中常用的模型有XAD-1600，D-101，D3520，HP-20，CAD-40 等[20]。

2.1.2 中等極性大孔樹脂

中極性大孔樹脂是以多官能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑的一種含有酯基的大孔樹脂，將其包裹在含醚基的整體中，并與多孔層相結(jié)合，其表面包括排水和剖面兩部分。中性多孔吸附樹脂可以從極性溶液中吸收非極性物質(zhì)，也可以將非極性溶液中的大多數(shù)極性物質(zhì)吸出，還可以將其作為脂族吸附劑，如聚丙烯酸酯類聚合物。中極性大孔樹脂在工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)中較常用的大孔樹脂類型有LX-28，ADS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-75 等[21]。

2.1.3 極性大孔樹脂

極性大孔樹脂（Polymer porous gap resin） 主要由含有酰胺基、氰基、酚羥基的樹脂組成，其中有的樹脂還可利用靜電作用對(duì)極性物質(zhì)進(jìn)行吸附，如丙烯酰胺。XAD-10、XAD-11、AD-12、NAK-9、DouliteXAD-761 等[19]都屬于極性大孔樹脂。

2.2 大孔吸附樹脂在總黃酮純化中的應(yīng)用

侯夢(mèng)陽(yáng)等人[7]采用比較試驗(yàn)對(duì)NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 等型號(hào)的大孔吸附樹脂的制備及其對(duì)玳玳花總黃酮的吸附、解析力進(jìn)行了測(cè)定，得出AB-8 型的提純效果最好；楊永濤[8]以3 個(gè)主要的孔解吸附速率樹脂為主要原料，通過(guò)對(duì)6 中樹脂（AB-8、D101、S-8、X-5、HPD-500NKA-9） 的吸附速率的比較，從羅布麻中篩選出高效的HPD-500 樹脂。荊常亮[9]的研究表明AB-8 型大孔樹脂是從草本植物中提取和提純總黃酮的最好方法，其純度可達(dá)79.62%。鄧夢(mèng)琴[10]用NKA 型大孔樹脂對(duì)菠蘿蜜中的總黃酮進(jìn)行富集純化，其總黃酮含量從16.74%上升到了84.42%。敬思群[11]使用AB-8 型大孔樹脂對(duì)昆侖雪菊中的總黃酮進(jìn)行了分離純化，結(jié)果表明，總黃酮含量由28.12%增加到52.43%，增加了86.5%。王雯[12]用D-312 型大孔樹脂對(duì)化橘紅中總黃酮進(jìn)行了分離純化，結(jié)果表明化橘紅中總黃酮的含量從14.16%上升至53.5%，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了上樣溶液pH 值為4、吸附流速1.0 mL/min 的洗脫條件下，pH 值為7，洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫溶液體積含量為80%。庫(kù)詠峰[13]通過(guò)對(duì)9 種不同型號(hào)大孔樹脂的靜態(tài)吸附以及動(dòng)態(tài)吸附的比較，發(fā)現(xiàn)HPD-500 型大孔樹脂的吸附性能比其他類型大孔樹脂更好，能夠使肉桂中總黃酮的提取率達(dá)到91.81%。林志欽[14]使用X-5 型大孔樹脂，對(duì)蓮子芯中的總黃酮化合物進(jìn)行了分離與純化，并確定了其最佳提純工藝：上樣質(zhì)量濃度5.1 mg/mL，上樣pH 值6，上樣流速為物料的2 倍體積每小時(shí)，上樣量為物料的2 倍體積，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，洗脫流速為物料的2 倍體積每小時(shí)，洗脫劑用量為4 倍體積。

3 總黃酮的生物活性

3.1 抗氧化活性

黃酮類物質(zhì)具有與其他抗氧化劑相似的抗氧化機(jī)制，其主要機(jī)制是產(chǎn)生氧原子，然后氧化生成多酚自由基。其氧化產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定，不容易被其他大分子所破壞，且具有良好的金屬絡(luò)合作用。這類化合物具有高度的離域性質(zhì)、完備的的大π 鍵共軛體系，強(qiáng)配體和適宜的立體結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，是一類非常理想的金屬離子配體。已有的研究表明，類黃酮金屬絡(luò)合物可顯著提高材料的抗氧化性。黃酮不但能抑制脂肪氧酶和NADH 氧化酶等酶的活力，起到抗氧化效果，還能使黃酮類化合物的抗氧化性能得到全面提高。梁證等人[22]采用AB-8 型大孔樹脂提純了仙人掌的果皮和果肉中的總黃酮，證明了仙人掌的抗氧化性。楊永濤[23]對(duì)羅布麻中總黃酮的大孔樹脂純化物產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，大孔樹脂純化產(chǎn)物對(duì)DPPH·，·OH，O2-·，ABTS+·等都有一定的清除作用，其抗氧化性比總黃酮粗提物強(qiáng)。吳婕等人[24]研究結(jié)果顯示，在甜茶葉中總黃酮的質(zhì)量濃度相同的情況下，經(jīng)提純后的總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除率降低了28.6%，結(jié)果表明，經(jīng)大孔樹脂純化后的甜茶葉總黃酮具有更強(qiáng)的抗氧化能力。王寒冬[25]研究發(fā)現(xiàn)，DM130 型大孔樹脂對(duì)趕黃草黃酮具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，并具有較強(qiáng)的還原能力。

3.2 抑菌活性

杜銀香等人[26]采用大孔樹脂法從華中枸骨葉中分離得到了一種有效成分，初步證明該成分具有一定的體外抗菌活性，且隨著該成分的含量的增加，其抗菌活性也隨之增強(qiáng)。賴譜富等人[27]在研究過(guò)程中，采用大孔樹脂分離純化了多年生藤本豆的總黃酮，結(jié)果表明，多年生藤本豆的總黃酮抗菌活性隨其濃度的增大而增大。孫丹丹[28]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，凍綠葉黃酮溶液種類相同的情況下，不同濃度的凍綠葉黃酮溶液的抑菌效果有明顯差異。龍旭等人[29]研究表明，丹參總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均有較強(qiáng)的抑菌效果，且對(duì)革蘭氏菌也有較強(qiáng)的抑菌效果，但在相同濃度丹參總黃酮的條件下，其抑菌效果具有明顯的大小差異：大腸桿菌＞金葡菌＞綠膿桿菌，說(shuō)明丹參總黃酮對(duì)細(xì)菌有較好的抑制作用。劉芮等人[30]在前期工作中發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮提取物可延長(zhǎng)3 種致病菌（金葡菌、大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌） 的感染延遲期，銀杏黃酮作用8 h 后，3 種致病菌細(xì)胞破裂，內(nèi)容物泄露；3 種致病菌在銀杏黃酮提取物處理4～12 h 后，其3 種致病菌菌液中的AKP 酶活性明顯升高；銀杏黃酮可是病原菌細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS） 升高，表明其可能是病原菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，使其失去存活能力。邵方宣[31]的研究表明，北橐吾總黃酮溶液在處理3 h后，能夠與Ecolid 的細(xì)胞成分相結(jié)合，破壞其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，引起Ecoli 細(xì)胞形態(tài)的顯著改變。另外，北橐吾總黃酮還能改變Ecoli 細(xì)胞膜的滲透性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)將Ecoli 細(xì)胞膜徹底破壞，造成Na+、K+、DNA 等物質(zhì)的大量外流，試驗(yàn)總結(jié)了黃酮類化合物的抗菌活性，黃酮類化合物能夠通過(guò)干擾細(xì)菌體內(nèi)DNA 的作用，影響體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)的平衡狀態(tài)，甚至?xí)茐哪繕?biāo)菌的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞中ROS 含量等，從而起到抑菌的效果。

4 結(jié)語(yǔ)

擬利用Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)雙酶輔助超聲波的方法，以八寶景天中總黃酮類化合物為研究對(duì)象，在降低其他因素干擾的同時(shí)，得到最佳的提取工藝，并極大地提高了總黃酮成分的提取率。通過(guò)對(duì)大孔樹脂吸附、分離和提純工藝的研究，不僅可以提高總黃酮的純度，還能夠去除粗提物中的雜質(zhì)，也能增強(qiáng)總黃酮的生物活性。近年來(lái)，隨著總黃酮化合物的提取和分離，以及對(duì)總黃酮化合物抗氧化和抑菌作用的研究，得到了廣泛的關(guān)注和深入，對(duì)八寶景天總黃酮的提取方法、大孔樹脂的純化方法及經(jīng)純化后的總黃酮抗氧化和抑菌活性進(jìn)行了綜述，以期為今后八寶景天總黃酮化合物的開發(fā)和利用提供一定的參考。