血漿游離DNA 甲基化靶向測序在乳腺癌中的應用價值

劉艷佳 ，李娜，王業滌，王 博

（1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤外科，黑龍江 佳木斯 154003）

乳腺癌（breast cancer）是女性常見的惡性腫瘤，高居我國女性惡性腫瘤發病率的第1 位。乳腺癌早期診斷仍依靠影像學，組織病理學是診斷的金標準，細胞涂片檢查的準確性仍待提高，目前在早期診斷上有很多研究將重點轉移到分子層面，探索更高敏感度和特異性的診斷方式。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，Ct-DNA）是由腫瘤細胞在壞死、凋亡后釋放到血漿中的游離DNA（cell-free DNA，Cf-DNA），其攜帶的遺傳信息與原發腫瘤組織保持著高度一致性，能克服常規組織活檢所無法突破的腫瘤異質性問題[1]。DNA 甲基化被證明是腫瘤發生的重要機制之一，是最常見的表觀遺傳修飾形式，S-腺苷甲硫氨酸的甲基基團在DNA 甲基化轉移酶作用下，轉移到胞嘧啶的5'位上，使之轉化為5'-甲基胞嘧啶[2]。DNA中富含CpG 島甲基化位點的區域稱之為CpG 島（CpG island），其主要分布在啟動子及第一外顯子區。很多腫瘤的發生與啟動子區的高甲基化抑癌基因沉默，低甲基化原癌基因激活有關。C1orf114，也稱為CCDC181，編碼含有181 的盤繞線圈結構域，是一種功能未知的蛋白質。CCDC181 高甲基化與許多癌癥有關，包括前列腺癌、肺癌、口咽鱗癌和乳腺癌等，且CCDC181 的甲基化和乳腺癌的早期診斷、術后監測以及預后中都有意義[3]。基于此，本研究擬從腫瘤標志物、血漿循環游離DNA 及CCDC181 甲基化層面探索乳腺癌的診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021 年12 月-2022 年6 月佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤外科收治的乳腺疾病患者的病歷資料。納入標準：①經臨床表現、實驗室檢查等確診，乳腺癌符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2021 版）》[4]中診斷標準；②臨床資料無缺失；③入院前未接受相關治療。排除標準：①非首次治療；②合并凝血功能障礙或其他影響本研究的疾病；③妊娠期女性；④合并其他部位腫瘤。最終納入50 例乳腺疾病患者，均為女性。按照病理檢查結果顯示，其中30 例乳腺癌患者作為實驗組（tumor組），20 例良性乳腺疾病患者作為對照組（control組）。實驗組年齡38～69 歲，平均年齡（45.96±6.6.51）歲；臨床分期按照AJCC 第8 版乳腺癌分期系統[5]分為0 期3 例，Ⅰ期12 例，Ⅱ期11 例，Ⅲ期4 例。對照組年齡38～70 歲，平均年齡（46.28±6.21）歲。兩組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過佳木斯大學生物和醫學倫理委員會的審批準。

1.2 腫瘤標志物檢測 CA153、CA125、CEA 均采用化學發光法檢測，試劑盒由羅氏公司提供。使用411 全自動化學發光免疫分析儀，嚴格按照操作規程進行測定。兩組受檢者均在清晨空腹狀態下采集4 ml 靜脈血，采血后盡快分離出血清，避免脂血和溶血，當日測定。正常參考值：CA153＜28 U/ml，CA125＜35 U/ml，CEA＜3.5 μg/ml。

1.3 DNA 提取及亞硫酸氫鹽處理 采集被檢查者10 ml 血樣置于EDTA 抗凝管，4 h 內完成離心、分裝等前處理。血樣本在4 ℃低溫情況下離心，先在3000 r/min 離心10 min，取上層清液再次16 000 r/min離心10 min 之后取上清血漿于-80 ℃冰箱凍存備用于Cf-DNA 提取以及靶向甲基化檢測。使用磁珠法通用型基因組DNA 提取試劑盒（DP705）（TIANGEN 公司）說明書提取血漿游離DNA，基于Acegen Targeted Methyl Panel 多重靶向亞硫酸鹽測序系統軟件設計目標序列多重亞硫酸鹽PCR 擴增引物池（上游引物池A 和下游引物池B，引物長度26～35堿基，退火溫度55 ℃～65 ℃，擴增子長度70～200 bp），具體各引物的序列見表1，擴增產物以使用于測序文庫制備。Cf-DNA 經過亞硫酸鹽轉化回收（ZYMO EZ DNA Methylation -Gold Kit，Zymo Research，Irvine，CA，USA），用于多重亞硫酸鹽PCR 擴增25～33 個循環；靶向擴增產物用1X 的磁珠（Agencourt AMPure XP，Beckman Coulter）純化回收后用于DNA小片段文庫制備。

表1 基因引物序列

1.4 TBS 靶向甲基化測序 在所有研究對象中隨機選抽取實驗組15 例，對照組10 例，進行下游CCDC181 基因啟動子區甲基化水平檢測。將制備好的文庫經Qubit 3.0 和安捷倫2100 Bioanalyzer 進行質檢測定濃度（構建及測序均由深圳艾斯基因科技有限公司完成），合格文庫用于NGS 測序，采用Illumina 測序系統，測序策略為雙端index 測序，測序讀長PE150；靶向區域測序擴增子深度不低于200X。甲基化水平均按如下公式進行計算：C 位點的甲基化水平=支持甲基化的reads 數/（支持甲基化的reads 數+支持非甲基化的reads 數）。并統計每個位點在每個樣本的中甲基化水平，其中如果深度小于30X 的，將表示為NA。

1.5 統計學分析 本研究采用SPSS 25.0 統計軟件對數據進行分析。非正態分布的計量數據用[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；符合正態分布的計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。ROC 曲線評價CA153、CA125、CEA 單獨及聯合檢測血漿Cf-DNA 甲基化及對乳腺癌的篩查價值。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腫瘤標志物水平比較 實驗組CA153、CA125、CEA 水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腫瘤標志物水平比較（）

表2 兩組腫瘤標志物水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

2.2 兩組血漿Cf-DNA 濃度比較 實驗組血漿Cf-DNA 濃度為（0.266±0.068）ng/ml，對照組為（0.227±0.074）ng/ml，兩組血漿Cf-DNA 濃度比較，差異無統計學意義（t=1.876，P=0.067），見圖1。

圖1 兩組血漿Cf-DNA 濃度比較

2.3 兩組CCDC181 啟動子區甲基化水平比較 TBS靶向甲基化測序實驗結果顯示，CCDC181 基因啟動子區上3 個CpG 位點：1984、2016 和2120（分別位于基因組169463204，169463236，169463340）的甲基化水平見圖2A；實驗組CCDC181 啟動子區CpG 島甲基化水平為[0.245（0.139，0.377）]，對照組為[0.024（0.018，0.035）]，兩組總體甲基化水平比較，差異有統計學意義（Z=6.440，P=1.889e-10），見圖2B。

圖2 兩組CCDC181 啟動子區甲基化水平比較

2.4 Cf-DNA 和CA153、CA125、CEA 單獨及聯合檢測篩查乳腺癌的價值

2.4.1 腫瘤標志物篩查乳腺癌的價值 ROC 曲線顯示，顯示CEA 診斷乳腺癌的靈敏度高于CA153 和CA125，特異度最高的是CA153，CA153、CA125 和CEA 三者聯合診斷乳腺癌的靈敏度、特異度及曲線下面積（AUC）均高于單一診斷，見圖3、表3。

表3 腫瘤標志物篩查乳腺癌的價值

圖3 血清腫瘤標志物的單獨及聯合篩查乳腺癌的ROC 曲線

2.4.2 CCDC181 啟動子區CpG 島甲基化水平篩查乳腺癌的價值 ROC 曲線顯示，CpG2120 診斷乳腺癌的靈敏度及特異度最高，CpG1984、CpG2016 及CpG2120 聯合診斷及單一診斷的靈敏度、特異度、AUC 高于CA153、CA125 和CEA 單一或聯合診斷。對比腫瘤標志物，CCDC181 啟動子區甲基化水平對乳腺癌的診斷能力更高，見圖4、表4。

圖4 CCDC181 啟動子區3 個CpG 島甲基化水平單獨及聯合檢測篩查乳腺癌的ROC 曲線

表4 CCDC181 啟動子區CpG 位點甲基化水平篩查乳腺癌的價值

3 討論

血清腫瘤標志物檢測是生化檢測，具有費用低廉，損傷小，實時操作、檢測便捷，患者易接受等特點，但是受不同個體以及技術條件限制，特異性及靈敏度不高，三者聯合可提高敏感度和特異度。乳腺癌常用的早期篩查方法有腫瘤標記物、乳腺超聲、乳腺核磁共振、乳腺鉬靶等檢查[6]。乳腺超聲檢查因其較低的特異性而受到質疑，造成了許多乳腺良性病變的活檢損傷[7]。目前組織活檢病理學診斷仍是診斷乳腺癌的金標準，但必須是影像學診斷結果或臨床表現提示可疑或高度惡性，才可以進行乳腺活組織檢查[8]。乳腺超聲和鉬靶檢查已被用于篩查，但取決于醫師經驗、患者年齡、乳房密度和絕經后荷爾蒙治療等因素，其敏感度在68%～93%[9]。Cf-DNA 檢測作為液體活檢技術，正成為一種創新的、微創的和高效的癌癥細胞研究方法，可以有效反映腫瘤細胞中基因的一些特征，如特異性突變、DNA 甲基化[10]等。有研究在組織中共發現了18 種乳腺癌特異性DNA 甲基化模式，最佳候選者EFC#93 被驗證用于臨床，是化療前樣本中獨立的不良預后標志物，說明血清DNA 甲基化模式的檢測為乳腺癌的早期診斷和管理提供了一個新工具[11]。Cf-DNA 及甲基化檢測，可以大大提高乳腺癌的早期診斷率并且可以監測治療效果。有研究通過在癌癥基因組成數據庫（TCGA）中對DNA 甲基化譜進行計算分析，結果建立了26 個具有標記的診斷預測模型，Cf-DNA 甲基化標記群具有較高的診斷能力，且與Cf-DNA 甲基化和乳房鉬靶診斷乳腺癌的能力相比，其比乳房鉬靶檢查優秀[12]。另有研究通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（PCR）測序的具有5 個甲基化差異標記物的基因組合可以將食管癌與健康對照者區分開來，其中診斷Ⅰ～Ⅳ期食管癌的特異性為91%，敏感性分別為43%、64%、77%和92%[13]。

本研究收集Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者和乳腺良性疾病患者血漿標本，檢測結果證實二者血漿Cf-DNA濃度基本一致，分析其原因與乳腺癌分期有關。有學者發現[14]，轉移性乳腺癌Cf-DNA 總量和循環腫瘤細胞（CTC）數量是總生存期（OS）的預測因素，而Cf-DNA 總量是無進展生存期（PFS）的唯一預測因素。考慮乳腺癌本身存在異質性，其中常見突變的頻率較低，很可能無法檢出帶有突變信息的DNA 片段。其次，在乳腺癌中Ct-DNA 分析的檢測靈敏度較低（＜40%）[15]，血漿中Ct-DNA 含量很低，臨床取樣時采集的血液量有限（一般10 ml），很可能無法檢出帶有突變信息的DNA 片段。

DNA 甲基化的修飾具有組織特異性、變化范圍廣、高敏感性等特點，非常適合作為癌癥早期檢測的標志物。有研究表明，GCM2、ITPRIPL1 和CCDC181的循環無細胞甲基化敏感度水平為97%，曲線下面積（AUC）為0.955，聯合檢測靈敏度水平可達100%，AUC 為0.961，且術后有明顯下降。這證明了CCDC181 甲基化是乳腺癌的早期診斷的良好生物標志物，具有高的敏感度和特異度，也可以用于乳腺癌的治療監測[3]。有研究使用靶向甲基化測序分析，計算治療前后結直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤和非小細胞肺癌患者甲基化評分，發現甲基化評分對結直腸癌的診斷準確率最高，其次是乳腺癌。低甲基化分數與高甲基化分數相比，與更長的生存期和更長的治療失敗時間有關，血漿Cf-DNA 甲基化評分與治療效果一致。Cf-DNA 甲基化不僅可以用于乳腺癌的早期診斷，也在乳腺癌治療的效果的監測中有很大的應用前景[16]。本研究發現，血漿Cf-DNA 甲基化、CCDC181 啟動子區甲基化水平可以有效診斷乳腺癌，若其聯合血清腫瘤標志物檢測，可提高篩查乳腺癌的敏感性和準確性，在乳腺癌早期篩查中具有較好的應用價值。本研究發現，乳腺癌患者血清CA153、CA125、CEA 及CCDC181 啟動子區甲基化水平均升高，說明血清CA153、CA125、CEA 水平變化在乳腺癌中呈現高表達狀態，證實了其與乳腺癌的相關性。其中CA153 是乳腺細胞上皮表面糖蛋白的變異體，當乳腺細胞發生癌變時，癌細胞會向血液循環中釋放，從而導致血清中的CA153 水平異常增高，早期乳腺癌的陽性檢出率可達60%，晚期乳腺癌的陽性檢出率高達80%，對乳腺癌患者的預后評估效果也較好，是目前公認的診斷乳腺特異性較高的一種腫瘤標志物[17]。同時CEA 診斷乳腺癌的靈敏度于三者之中最高，但是仍不及CCDC181 的診斷能力。CCDC181 啟動子區的CpG 位點檢測乳腺癌的能力高于腫瘤標志物，其診斷乳腺癌的靈敏度及特異度均高于90%，三者聯合特異度可高達95%。CCDC181 基因編碼的包含卷曲結構域的蛋白家族的一個新成員的分子特征。CCDC181 是一種Hook1相互作用蛋白[18]。在眾多研究中，可以發現CCDC181 甲基化在癌癥診斷中的巨大潛力，如前列腺癌[19]、口咽鱗狀細胞癌[20]、肺腺癌[21]、和乳腺癌[22]等癌癥中，CCDC181 的甲基化是新的診斷和預后癌癥生物標志物，可能指導臨床實踐中的治療決策。

本研究的不足之處主要有2 個方面：一是樣本量較小，二是未納入健康人進行對照實驗。在今后的研究中需增加樣本量，同時開展健康人群血漿Cf-DNA 甲基化檢測，進一步驗證其診斷效能。

綜上所述，乳腺癌患者外周血中的Cf-DNA濃度與乳腺良性疾病患者無差異，不能通過Cf-DNA濃度區分二者。而通過高通量測序檢測Cf-DNA 中特定區域的甲基化，可以有效地區分乳腺癌與乳腺良性疾病。CCDC181 啟動子區3 個CpG 位點可以進行Cf-DNA 無創液體活檢多靶點甲基化檢測，聯合血清腫瘤標志物可提高乳腺癌篩查的敏感性和準確性，具有較好的臨床價值，可作為潛在的乳腺癌輔助診斷指標。