生信分析腎陽虛型絕經后骨質疏松癥分子機制及淫羊藿的靶向治療機制

蔣 俊，毛國慶

（南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科，江蘇 南京 210000）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指女性絕經后發生骨組織結構改變、骨量減少及骨的脆性增強的一種疾病，其原因是雌激素水平的下降，多于女性絕經后5～10 年發生[1]。骨折是PMOP 并發癥中最嚴重的一種，在縮短患者生存周期的同時，嚴重影響患者的身心健康。2018年全國首次骨質疏松流行病學調查結果顯示[2]，我國50 歲以上男性骨質疏松患病率僅為6.0%，而同年齡段女性患病率高達32.1%。因此，PMOP 的防治不僅是一個健康問題，而且是一個社會問題。傳統醫學中沒有“骨質疏松”的病名記載，但根據其病因病機、發病特點及臨床癥狀，目前常認為其屬于中醫“骨痿”“骨枯”“骨蝕”等范疇。中醫認為骨質疏松發生的根本病因是腎虛。《黃帝內經》中提及：“腎主骨，生髓?！币虼?，腎虛會導致生髓功能的減弱，進而引起骨髓空虛，骨強度減弱，最終導致骨質疏松癥。根據相關統計[3]，淫羊藿在防治PMOP 的中藥復方中占很大比例，許多臨床防治PMOP 的驗方中都含有淫羊藿，其使用頻率僅次于熟地黃位居第2 位，是治療腎陽虛型PMOP 的最基礎藥物。淫羊藿屬于小蘗科植物，亦稱“仙靈脾”，《中國藥典》中記載其性味辛甘溫，歸肝腎經，有壯腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。淫羊藿中有效成分復雜。現代藥理學研究發現[4]，淫羊藿苷是淫羊藿中含量最高的成分，能夠抑制卵巢摘除大鼠的骨丟失，減緩骨密度下降，改善骨骼力學性能和骨小梁微結構。盡管目前有很多關于淫羊藿與PMOP 相關的研究報道，但其治療腎陽虛型PMOP 的作用機制仍不是十分明確。因此，本研究借助網絡藥理學深入分析其作用靶點及作用通路，從整體論治淫羊藿與腎陽虛型PMOP 的關聯性，為臨床應用和后續試驗研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 資料來源及差異基因分析 在公共基因芯片數據庫（gene expression omnibus，GEO）中，以“postmenopausal osteoporosis”“kidney yang dificiency”為檢索詞，設定篩選條件為人（Homo spaiens）進行搜索，檢索到GSE56116 芯片數據集。該數據集由13例樣本構成，其中10 例絕經后骨質疏松癥患者分為腎陰虛（4 例）、腎陽虛（3 例）、非腎虛（3 例）3 組，另外3 例為絕經后健康婦女。從GEO 數據庫中下載GSE132550 的基因表達譜，利用limma 包對絕經后健康婦女及腎陽虛絕經后骨質疏松癥婦女進行差異基因分析，標準設定為|logFC|≥1且P＜0.05，結果以火山圖呈現。

1.2 腎陽虛型PMOP 靶點獲取 在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）及OMIM數據庫（https://www.omim.org/）中，以“postmenopausal osteoporosis”為關鍵詞進行檢索并收集PMOP 的相關基因，結果與1.1 中的差異基因進行匹配，得到重合部分基因即為腎陽虛型PMOP 的靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建 將獲得的腎陽虛型PMOP 靶點輸入STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/）中，選擇物種為人類（Homo spaiens），隱藏未連接的節點，其他參數選擇默認設置，進行蛋白互作分析，結果導入3.9.0 版本Cytoscape 軟件中可視化，利用Cytoscape 軟件cyto－Hubba 插件獲得連接度值前10 的核心靶點。

1.4 GO 及KEGG 富集分析 將腎陽虛型PMOP 的靶點輸入到DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）中，選擇人類（Homo spaiens）且P＜0.01，進行GO 生物過程和KEGG 通路富集分析，分析腎陽虛型PMOP 的潛在病理機制。

1.5 淫羊藿活性成分及潛在靶點篩選 在TCMSP 數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）搜索淫羊藿（Epimrdii Herba）的化學成分，設置篩選條件：口服利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18，初步篩選出淫羊藿的活性成分及其作用靶點。運用R 軟件對連接度值前10 的腎陽虛型PMOP 核心靶點進行匹配映射，獲得潛在治療靶點。

1.6 計算機分子對接 在PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）及PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，分別下載潛在治療靶點蛋白3D 結構pdb 格式文件及化合物3D 結構的sdf 格式。使用DockThor 進行分子對接。

2 結果

2.1 差異表達基因 在GEO 數據庫中最終得到腎陽虛型PMOP 的基因表達芯片（GEO 編號：GSE56116），對其進行分析，結果顯示腎陽虛型PMOP 患者低表達基因有313 個，高表達196 個，見圖1。

圖1 差異表達基因火山圖

2.2 腎陽虛型PMOP 靶點 在GeneCards 數據庫獲得腎陽虛型PMOP 靶點1153 個、OMIM 數據庫獲得腎陽虛型PMOP 靶點45 個，去除重復，共得到PMOP 相關靶點1187 個，將腎陽虛型PMOP 差異表達基因與PMOP 靶點導入Venny 2.1，獲得48 個交集靶點，即為腎陽虛型PMOP 的靶點，見圖2。

圖2 腎陽虛型PMOP 靶點

2.3 PPI 網絡 將48 個腎陽虛型PMOP 靶點基因導入STRING 數據庫在線進行互作分析，共得到35 個節點，90 條連線，見圖3，其中連線表示蛋白質與蛋白質之間的相互作用的證據，節點表示蛋白質，相互關系計數越多，說明該靶點基因在治療腎陽虛型PMOP 中起到的作用越重要，利用Cytoscape 軟件cytoHubba 插件篩選出連接度值前10 的核心靶點基因，見表1。

表1 腎陽虛型PMOP 核心靶點

圖3 腎陽虛型PMOP 靶點基因PPI 網絡

2.4 富集分析結果 GO 富集分析得到42 個結果，分別選擇展示前5 個基因功能，見圖4，生物學過程主要為參與細胞增殖、細胞遷移過程調節等；細胞組分主要有細胞外區域、外泌體等；分子功能主要有蛋白酶結合、整合素結合等。KEGG 通路富集分析得到6個結果，見圖5，富集的通路有PI3K-Akt 信號通路、Th17 細胞分化、化學致癌受體激活、脂質與動脈粥樣硬化、哮喘、類風濕性關節炎相關通路。

圖4 GO 富集分析

圖5 KEGG 富集分析

2.5 淫羊藿活性成分及潛在靶點篩選 按條件篩選獲得淫羊藿活性成分23 種，治療靶點467 個，將治療靶點與連接度前10 的腎陽虛型PMOP 核心靶點導入Venny 2.1，得到潛在治療靶點EGF、CRP、FOS、MMP1，對應活性成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）。

2.6 小分子結構文件獲取及分子對接 將槲皮素、木犀草素、山柰酚分別與潛在靶點基因EGF、CRP、FOS、MMP1 兩兩組合，進行分子對接，見表2。一般默認當配體與受體結合的構象越穩定時，結合能值越小，發生作用的可能性越大，對接結果顯示對接能量均低于-5 kJ/mol，說明藥物活性成分與疾病靶點能夠良好結合。根據最低結合能的結果，與槲皮素親和力最高的是EGF、與山柰酚親和力最高的是EGF、與木犀草素親和力最高的是CRP。

表2 分子對接結果（kJ/mol）

3 討論

傳統醫學沒有“絕經后骨質疏松”的病名記載，但根據其周身疼痛，彎腰駝背，不能負重，易發骨折等表現，常常將其歸于“骨痿”“骨枯”“骨蝕”“骨疏”等范疇，其中尤其與“骨痿”類似?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗匪d：“女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭?！惫手嗅t理論認為女子絕經后，天癸衰竭，腎虛精虧，骨髓化源不足，骨骼失于榮養，導致骨量減少，發為本病?！毒霸廊珪ゐ粽摗分姓f：“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發為骨痿?！币嗾J為PMOP 的根本病因是腎精虧虛，腎虛則不能生髓，髓不能養骨則骨枯，最終發展為骨痿。淫羊藿作為治療腎陽虛型PMOP 的常用藥物，療效顯著，但其具有多成分、多靶點相互作用的特點，活性成分群與作用機制尚不清晰，限制了其臨床推廣使用。本研究借助網絡藥理學的方法，擬闡明淫羊藿的作用，探討其干預腎陽虛型PMOP 的作用機制。

本研究發現，腎陽虛型PMOP 患者血液樣本中表達下調基因有313 個，上調基因有196 個，將其與PMOP 相關基因進行映射匹配，結果得到腎陽虛型PMOP 相關的靶基因48 個，對獲得的48 個靶點構建PPI 網絡。結果顯示，EGF、FGF2、CRP、VWF、ITGB3、IRS1、MMP1、SELP、FOS、PRL 等靶點具有較高度值，可能是腎陽虛型PMOP 的核心靶點。研究證明[5]，EGF 是一種單鏈低分子多肽，能夠與受體EGFR 結合促進細胞增殖和組織修復。當EGF 與EGFR 相結合時，EGFR/MEK/ERK1/2 信號通路會被激活，進而誘導成骨細胞增殖[6]。CRP 是一種炎癥因子，能夠代表機體的炎癥水平。韓學明等[7]發現，hs-CRP 水平與絕經后女性的骨密度存在高度相關性。同時既往研究發現慢性炎癥疾病可造成RANKRANKL-OPG 軸失衡，促進破骨細胞生成，增強骨吸收，最終導致PMOP 的發生[8，9]。MMP1 則是一種基質金屬蛋白酶，由成骨細胞分泌。有研究發現MMP1水平與骨質疏松存在相關性[10]。朱偉等[11]發現MMP1可以促進成骨細胞的分化和改善骨質疏松。楊全增等[12]通過實驗驗證了MMPs 表達量的上調可以抑制骨基質和Ⅰ型膠原的過度降解，維持骨重建平衡。FOS 是一種核內磷酸蛋白，有研究證明其表達受RANKL 調控，當RANKL 與受體結合時，能夠刺激C-FOS 的生成，整個過程能夠刺激破骨細胞分化增加，影響骨吸收，導致骨質疏松[13]。Takayanagi H等[14]發現抑制C-FOS 的表達可以減少促炎因子生成，阻止炎癥發生及進展，進而抑制破骨細胞活化，最終改善骨質疏松。

本研究通過GO 富集分析及KEGG 通路分析發現，腎陽虛型PMOP 與PI3K-Akt 信號通路、Th17 細胞分化、化學致癌受體激活、脂質與動脈粥樣硬化、哮喘、類風濕性關節炎通路有關。其中PI3K-Akt、Th17 細胞分化信號通路通過多種方式參與信號傳導，與骨質疏松關系密切[15，16]?，F代研究發現[17]，PI3K-Akt 通路是參與炎癥反應及骨代謝失衡的關鍵通路之一，激活PI3K-Akt 通路可引起成骨細胞凋亡、破骨細胞生成及骨吸收控制節點失衡，導致骨代謝異常及骨質疏松的發生。另有研究發現[18]，Th17細胞分化通路亦與骨質疏松存在聯系。女性絕經后雌激素缺乏能夠增強Th17 細胞分化功能，進而導致IL-17 分泌增多，而IL-17 能夠增加來自成骨細胞的促破骨細胞因子來誘導骨丟失，加劇骨量的減少，最終導致PMOP 的發生。

本研究得到淫羊藿的23 種活性成分，對應467種治療靶點。其中槲皮素、山柰酚、木犀草素可能作用于EGF、CRP、FOS、MMP1 發揮抗骨質疏松的作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均為黃酮類化合物，具有抗骨質疏松的作用。實驗研究發現[19，20]，槲皮素能夠促進BMSCs 增殖和成骨分化，抑制骨丟失，增加骨密度，改善骨質疏松。山柰酚可能通過下調c-Fos的表達減少破骨細胞的生成，治療骨質疏松[21]。木犀草素可能通過激活PI3K-Akt 信號通路從而改善PMOP 大鼠的骨丟失[22]。本研究選取活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草與潛在治療靶點EGF、CRP、FOS、MMP1 進行對接，結果顯示，對接能量均低于-5 kJ/mol，可知藥物的主要有效成分進入機體后能與潛在治療靶蛋白有良好的親和力，表明淫羊藿以多成分協同的形式作用于多個關鍵靶點，發揮治療腎陽虛型PMOP 的作用。

綜上所述，淫羊藿中的槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通過EGF、CRP、FOS、MMP1 靶點與PI3KAKT、Th17 細胞分化通路治療腎陽虛型PMOP。