加權共表達網絡分析在肝癌環狀RNA 研究中的應用

王俐勇，趙煥英，付文卓，楊予濤

（首都醫科大學中心實驗室1，基礎醫學院2，北京 100069）

肝癌（liver cancer）是一種常見惡性腫瘤，占所有癌癥死亡11%，排名第2位[1]。肝癌發展過程中伴隨肝細胞增殖和脂肪變性、氧化應激、線粒體損傷和活性氧誘導，但其發生機制尚未完全明確。已有研究表明[2]，肝癌發展與癌細胞中核酸蛋白水平變化相關，找到合適分子生物標志物有助于研究肝癌發病機制及進行個性化治療。1976 年首次在RNA 病毒中發現環狀RNA（circRNAs），近年來隨著RNA 測序技術和生物信息學發展，發現cirRNAs 作為蛋白復合物中的支架結構，從亞細胞定位隔離蛋白，調節親本基因表達，調節選擇性剪接和RNA-蛋白質相互作用，形成microRNA 海綿結構。circRNAs 與線性RNA 不同，其具有圓形共價鍵結構，對核酸外切酶耐受性更高。研究表明[3，4]，circRNAs 可能參與腫瘤發生發展。WGCNA 共表達網絡分析可用于microRNA 和非編碼長鏈RNA 研究，通過構建共表達模塊可挖掘篩選關鍵基因[5]。本研究探討加權共表達網絡分析在肝癌環狀RNA 研究中的應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據下載和收集 通過GEO 網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載肝癌數據集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE97332），將得到的circRNA 表達原始值均一化。從NCBI 數據庫下載circRNA 芯片數據GSE97332（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE97332），包括14 例肝癌數據，其中7 例腫瘤組織，7 例正常組織。

1.2 數據集差異基因篩選分析 利用DESeq2 包（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）按照差異倍數大于2 倍，P值小于0.05 標準對肝癌circRNA 進行差異表達分析。

1.3 WGCNA 共表達分析 該數據集共檢測到3032個circRNA 分子，均一化后應用WGCNA 方法構建circRNA 共表達網絡。應用R 軟件包WGCNA 構建共表達網絡，通過以下公式構建加權鄰接矩陣Sij=|cor（Xi，Xj）|aij=Sijβ，其中i 和j 代表不同的circRNA，Xi 和Xj 代表circRNA 的表達量，Sij 表示皮爾遜相關系數，aij 表示2 個circRNA 之間的相關系數。本研究中選擇軟閾值β=10，無尺度模型擬合系數R2=0.91。

1.4 確定關鍵circRNA 將鄰接矩陣轉化成拓撲矩陣（TOM），TOM 矩陣是定量網絡節點之間加權關系相似性的方法，然后通過層次聚類確定模塊，每個模塊至少包含30 個circRNA，最后確定可能在肝癌起關鍵作用的circRNA。

1.5 基因富集分析和聚類 應用circRNA 在線數據庫（https://circinteractome.nia.nih.gov/）篩選出circRNA 可能結合的miRAN，通過miRNA 數據庫（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）得 到miRNA對應的靶基因，利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）在線分析工具對靶基因進行KEGG 通路富集分析。

1.6 qPCR 驗證 DMEM 培養液和10%胎牛血清體外培養人肝癌細胞系（HepG2）和正常肝細胞系（L02），收集細胞懸液使用TRIzol 從這些細胞中分離總RNA，通過RNase R 處理提高circRNA 的濃度，逆轉錄后使用實時定量qPCR 分析定量circRNA。以β-actin為內參照，PCR 的反應條件：95 ℃2 min、95 ℃15 s、58 ℃60 s，共40 個循環，qPCR 引物序列見表1。

表1 circRNA 引物序列

1.7 生存分析驗證 通過Kaplan-Meier plotter 數據庫（http://kmplot.com/analysis/index.php）對篩選出來circRNA 靶向的microRNA 進行生存分析驗證。

2 結果

2.1 數據均一化和選擇軟閾值 共檢測到3032 個circRNA 分子，均一化后應用WGCNA 方法構建circRNA 共表達網絡，當軟閾值為10 時，基因之間連通性符合無尺度網絡分布，無尺度模型擬合系數R2=0.91，見圖1。

圖1 WGCNA 軟閾值確定

2.2 共表達模塊構建與肝癌相關模塊的關系 應用WGCNA 方法共得到7 個模塊，其中Turquoise 模塊與肝癌組織呈正相關（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 Turquoise 模塊與肝癌組織的相關性

表2 共表達模塊構建與肝癌相關模塊的關系

2.3 circRNA 與miRNA 關聯基因篩選 Turquoise 模塊中circRNA 表達量在肝癌組織中均表達上調，見表3。經過在線數據庫比對篩選出hsa_circ_0064324和hsa_circ_0040827 進一步分析，共篩選出hsamiR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p和hsa-miR-942-3p 四個miRNA 分子，然后通過miRWalk 數據庫miRDB、TargetScan、miRTarBase 軟件篩選出這些miRNA 對應的靶基因，構建circRNA-miRNA-mRNA 網絡，見圖3。

圖3 肝癌中circRNA-miRNA-mRNA 相互作用網絡圖

表3 Turquoise 模塊中circRNA 量表達

2.4 功能富集分析驗證 提取miRWalk 數據庫miRDB、TargetScan、miRTarBase 軟件篩選得到miRNA靶向基因，利用David 在線分析軟件對這些基因進行Pathway 富集分析，結果顯示這些靶向基因富集在鞘磷脂信號通路、癌癥蛋白聚糖、血小板活化通路、胰腺癌通路、神經膠質細胞瘤、FoxO 信號通路、癌癥中膽堿代謝通路等多個和癌癥相關的通路上，見圖4。

圖4 KEGG 富集通路分析

2.5 功能驗證 體外培養人肝癌細胞系（HepG2）和正常肝細胞系（L02），并對篩選到的hsa_circ_0064324和hsa_circ_0040827 定量檢測，可見在肝癌細胞系中hsa_circ_0064324 和hsa_circ_0040827 均表達上調，見圖5。Kaplan-Meier 生存分析發現，hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達與肝癌總體生存期呈負相關（P＜0.05），見圖6。

圖5 關鍵circRNA 在不同細胞系中表達

圖6 miRNA 生存分析驗證

3 討論

circRNA 是一類封閉環狀非編碼RNA，分為外顯子環狀RNA、內含子環狀RNA，通過和miRNA 結合在轉錄、轉錄后以及翻譯和翻譯后水平調控基因表達發揮重要作用。circRNA 具有表達相對穩定、表達調控有時空特異性、成環序列保守等優勢，在肝癌發生機制研究中備受關注[6]。目前已發現circRNA-5692[7，8]、circRNA-100338[9，10]、hsa_circRNA_104348[11，12]與 肝癌發生發展相關。這些環狀RNA 通過內源競爭RNA（ceRNA）機制結合miRNA 分子導致靶基因沉默，影響肝癌細胞侵襲轉移。由于肝癌發生發展機制復雜，需要更好的方法挖掘更多肝癌相關環狀RNA 以揭示肝癌調控機制。

circRNA 芯片具有通量高檢測靈敏度高特點，可以對人體內大多數circRNA 同時高效檢測。本研究利用芯片數據中circRNA 之間相互關聯絕對值定義共表達網絡，通過一個鄰接矩陣定義相互關聯權重，采用軟閾值參數構造加權網絡，使用拓撲重疊度量（TOM）作為鄰近度量，結合2 個鄰接circRNA 相互作用強度，聚類成網絡模塊[13，14]。另在網絡模塊中，應用主成分分析計算出主成分和臨床性狀相互關系，確定與肝癌相關模塊，并依據circRNA 與主成分模塊相互關系確定出關鍵circRNA[15，16]。本研究從與肝癌正相關Turquoise 模塊中挑選出上調表達cir cRNAs，經文獻數據庫比對篩選出hsa_circ_0064324、hsa_circ_0040827 進一步分析，利用qPCR 定量檢測發現在肝癌細胞系HepG2 中它們均表達上調，并在數據庫中發現這些circRNA 可能通過競爭結合hsa-miR-146b、hsa-miR-942、hsa-miR-331、hsa-miR-874；經生物信息學分析發現，這些microRNA 分子下游靶基因多富集在與癌癥發生發展相關通路。有研究證明[17]，FoxO 信號通路與肝癌轉移密切相關,該通路中FoxO 轉錄因子調節多種生物過程，包括細胞增殖、死亡、衰老、血管生成、細胞遷移和轉移所必需的基因。

預后評價是制定臨床方案重要參考之一，對于延長患者生存期意義重大。Li C等[18]研究發現，TRAF6（TNF 受體相關因子）為肝癌中miR-146b-5p靶向位點，通過抑制TRAF6 介導AKT 通路磷酸化可減少肝癌細胞生長和轉移。Zhang QF等[19]研究發現，與正常組織相比，肝癌組織和細胞系中miR-942-3p 表達水平升高，并與病理分期和腫瘤淋巴結轉移分期相關，是肝癌患者生存率低的獨立預后因素。PH 域和亮氨酸豐富重復蛋白磷酸酶（PHLPP）是miR-331-3p 靶點，miR-331-3p 通過抑制PHLPP 介導AKT 通路去磷酸化，促進肝癌細胞增殖。在肝癌細胞系PLC/PRF/5 中過表達的miR-874-3p 會抑制癌細胞生長，促進癌細胞凋亡。本研究Kaplan-Meier生存分析發現，hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達與肝癌總體生存期呈負相關，即表達量越低，患者肝癌預后生存期越長，提示hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達有可能是患者不良預后獨立預測因子。

綜上所述，利用WGCNA 方法篩選出hsa_circ_0064324 和hsa_circ_0040827，經生物信息學分析認為其可能結合hsa-miR-146b-3p、hsamiR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p，間接調控下游靶基因表達，影響腫瘤細胞增殖侵襲，這兩個circRNA 分子可能作為肝癌的生物標記物和治療靶點，對肝癌診斷和治療有積極意義，然而如何調控靶基因作用于癌癥發生與轉移仍有待進一步探索。