核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體在腦卒中后認知障礙中的研究進展

李曉曉，白艷杰，王巖，張雍闖，陳淑穎，陳麗敏

腦卒中后認知障礙（PSCI）是指腦卒中患者發病后6個月內出現符合認知障礙診斷標準的系列綜合征［1］，臨床主要表現為執行功能、注意力、記憶、言語、視空間能力等一項或多項認知領域的受損［2］，嚴重影響腦卒中患者的生活質量。研究表明，超過1/3的腦卒中患者存在不同程度的認知功能下降［3］，且隨著全球社會老齡化問題的日益突出，PSCI患者不斷增多，給個人、家庭和社會帶來了沉重的負擔。目前PSCI的發病機制尚不明確，神經炎癥被認為是一個重要因素。大量實驗證據表明，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化在PSCI中起關鍵作用［4-5］。NLRP3炎癥小體被腦卒中后引起的多種細胞內信號激活，介導慢性神經炎性反應、神經元死亡和細胞焦亡等，從而促進PSCI的發生和進展［6］。更重要的是，已有研究證實使用針對NLRP3炎癥小體的抑制性治療可以減輕腦卒中小鼠的認知障礙［5］，但具體作用機制尚未完全清楚。因此，本文對NLRP3炎癥小體的活化和影響因素及其與PSCI的關系做一總結，以期為PSCI的臨床治療研究提供參考。

本文文獻檢索策略：計算機檢索PubMed、Web of Science、中國知網、萬方數據知識服務平臺等數據庫，并手工檢索納入文獻的參考文獻，檢索時間為建庫至2022年5月，中文檢索詞包括“NLRP3炎癥小體”“神經炎癥”“腦卒中后認知障礙”，英文檢索詞包括“NLRP3 inflammasome”“NLRP3”“post-stroke cognitive impairment”。文獻納入的標準：基于調控NLRP3炎癥小體改善腦卒中后認知障礙的臨床研究、基礎研究和文獻研究。文獻排除的標準：重復發表的文獻、無法獲取全文和數據的文獻、年份陳舊、質量較差的文獻等。

1 NLRP3炎癥小體表達與活化的影響因素

1.1 NLRP3炎癥小體的結構 炎癥小體是一種細胞溶質多蛋白復合物，在先天性免疫中起著重要作用，主要由胞質內模式識別受體（PRRs）、銜接蛋白結構域和效應結構域半胱氨酸蛋白酶1前體（pro-caspase-1）3部分組成［7］。在中樞神經系統中，炎癥小體主要存在于免疫細胞、神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞的細胞質中［8］，可以識別病原體相關分子模式（PAMPs）和宿主來源的損傷信號相關分子模式（DAMPs）。NLRP3炎癥小體是目前報道中研究最多的炎癥小體，與上述炎癥小體的結構一樣，NLRP3炎癥小體包括NLRP3、銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和效應蛋白pro-caspase-1［9］。這3種蛋白質通過緊密相互作用以調節NLRP3炎癥小體的功能。

1.2 NLRP3炎癥小體的活化 目前研究已證實的誘導NLRP3炎癥小體活化的外源性刺激因子包括脂多糖（LPS）［10］、病毒RNA［11］、棕櫚酸酯［12］、二氧化硅［13］等，內源性刺激因子包括活性氧（ROS）［6］、組織蛋白酶B［14］、三磷酸腺苷［15］等。盡管上述因素誘導的NLRP3炎癥小體的活化過程已被廣泛研究，但其確切的分子機制仍需進一步探索。目前認為有兩種激活NLRP3炎癥小體的信號通路，一種是涉及pro-caspase-1募集和caspase-1激活的經典信號通路，另一種是與小鼠caspase-11和人類caspase-4、caspase-5激活有關的非經典信號通路。

1.2.1 NLRP3炎癥小體的經典活化途徑 NLRP3炎癥小體的活化包括啟動和激活兩個步驟［16］。在細胞靜止狀態下，NLRP3和白介素1β（IL-1β）的基礎水平被認為不足以激活炎癥小體。因此，啟動步驟促進了這些目標的轉錄。第一個階段是啟動階段，NLRP3受到危險信號〔如Toll 樣受體 4（TLR4）激動劑或內源性分子〕的刺激，誘導核因子-κB（NF-κB）表達，從而促進NLRP3、IL-1β和白介素18（IL-18）基因的轉錄，使NLRP3、IL-1β前體（pro-IL-1β）和pro-IL-18的蛋白質表達增加［17］。第二個階段是激活階段，通常由PAMPs或DAMPs觸發，從而完成NLRP3炎癥小體的組裝步驟。隨后pro-caspase-1通過接頭蛋白ASC募集，成簇的pro-caspase-1通過自催化和自切割形成活化的caspase-1，后者切割pro-IL-1β和pro-IL-18產生活化形式的IL-1β和IL-18。同時，活化的caspase-1可以通過裂解消化道皮膚素D（GSDMD），引發細胞焦亡［18］。

1.2.2 NLRP3炎癥小體的非經典活化途徑 在非經典激活途徑中，NLRP3炎癥小體的活化主要是由小鼠caspase-11或人類caspase-4和caspase-5介導的。革蘭陰性菌產生的LPS進入細胞質，可以與小鼠體內的caspase-11結合，從而觸發其寡聚化和活化。活化的caspase-11誘導細胞焦亡并產生促炎細胞因子［19］。

1.3 NLRP3炎癥小體活化的影響因素 NLRP3炎癥小體活化的主要機制包括K+外流、溶酶體破壞后釋放的組織蛋白酶B、細胞外Ca2+穩態的變化以及ROS的產生［20］等。最新研究表明，線粒體是NLRP3炎癥小體功能的中心調節劑，線粒體活性氧（mtROS）的產生、線粒體DNA（mtDNA）的釋放、線粒體介導的細胞凋亡、線粒體鈣超載以及線粒體參與NLRP3的定位均與NLRP3炎癥小體活性的調節有關［21-22］。因此，本文主要討論線粒體功能障礙、線粒體相關內質網膜（MAM）、自噬和線粒體自噬在NLRP3炎癥小體活化和調控中的作用。

1.3.1 線粒體功能障礙和NLRP3炎癥小體活化 線粒體是細胞的代謝中心和能量工廠，提供細胞生物合成所需的底物和能量，對細胞命運起著決定性作用。線粒體在有氧代謝過程中通過呼吸鏈產生mtROS。當線粒體功能受損時，mtROS水平顯著升高，mtROS在細胞質中積累并與NLRP3炎癥小體的成分相互作用，從而參與炎癥小體的活化。NAKAHIRA等［23］研究發現受損線粒體產生的mtROS是巨噬細胞激活NLRP3炎癥小體所必需的。此外，越來越多的證據表明，使用破壞線粒體功能的化學抑制劑可觸發NLRP3炎癥小體活化。線粒體功能障礙誘導劑，如魚藤酮（復合物Ⅰ抑制劑）可導致ROS水平升高、NLRP3炎癥小體的活化以及小膠質細胞中IL-1β的表達［24］。此外，mtROS清除劑MitoTEMPO可抑制損傷因子誘導的NLRP3炎癥小體的活化，并減少IL-1β的分泌［25］。

線粒體功能障礙導致線粒體斷裂增加，釋放出mtDNA、ATP、熱休克蛋白60（HSP60）、線粒體轉錄因子A（TFAM）、心磷脂等。這些物質可作為DAMPs來誘導NLRP3炎癥小體的活化［26］，其中mtDNA的研究最為廣泛。NAKAHIRA等［23］研究表明mtDNA的釋放對于NLRP3炎癥小體的活化至關重要，并依賴于ROS的產生。SHIMADA等［27］進一步利用轉染mtDNA的293細胞證明mtDNA可以直接與NLRP3結合并介導NLRP3炎癥小體的活化。細胞質中氧化mtDNA水平的增加亦可促進NLRP3炎癥小體的活化［28］。艾地苯醌是一種眾所周知的線粒體保護劑，PENG等［29］在氧葡萄糖剝奪/再灌注（OGD/R）損傷模型中發現，線粒體功能障礙導致mtDNA易位、mtROS產生以及氧化mtDNA的細胞溶質積累，促進其與NLRP3的結合。而通過艾地苯醌治療能有效阻斷這一過程，并減輕OGD/R后NLRP3介導的炎癥損傷。

1.3.2 線粒體相關內質網膜對NLRP3炎癥小體活化的調控 由內質網的亞結構域、線粒體外膜和一系列蛋白組成的動態連接稱為MAM［30］，其在物質轉移和信號轉導中起著重要作用。ZHOU等［31］研究發現在細胞未受刺激時，NLRP3主要位于內質網膜和細胞質中。然而細胞在受刺激后，NLRP3和ASC將重新分布并轉移到核周區域的MAM，這使得其更容易感知線粒體損傷信號。MAM也被視為炎性體組裝和激活的平臺。在炎性體形成過程中，乙酰化的α-微管蛋白可以將線粒體遷移到核周區域，并促進線粒體上的ASC與內質網上的NLRP3組裝［32］。線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）是位于線粒體外膜的銜接分子，參與Ⅰ型干擾素的分泌。作為MAM的重要組成部分，MAVS在調節宿主的自然免疫中起著重要作用。研究發現，MAVS可以將NLRP3募集到線粒體，以應對病毒感染。MAVS與NLRP3的N端氨基酸序列相連，這是MAVS與NLRP3相互作用的基礎［33］。此外，GUAN等［34］研究證明MAVS能夠通過將E3連接酶TRAF3募集到ASC來穩定ASC并誘導胞質斑點的形成。MAVS或TRAF3缺乏會損害ASC泛素化和細胞質斑點的形成，從而降低NLRP3炎癥小體的活化。

Ca2+在NLRP3炎癥小體活化中起重要作用［35］。MAM是介導Ca2+從內質網向線粒體轉運的主要位點。IP3R-GRP75-VDAC-MCU復合物是介導內質網Ca2+通過MAM區域轉運至線粒體的經典途徑［36］。這些蛋白質也是MAM的組成成分，針對這些蛋白質的抑制劑或基因敲除可能會減弱NLRP3炎癥小體的活化。因此認為MAM功能的改變會影響NLRP3炎癥小體的活化。

1.3.3 NLRP3炎癥小體通過自噬和線粒體自噬負調控

自噬是細胞自身成分如細胞器和異常積累蛋白通過溶酶體系統非特異性降解的過程，對于維持細胞穩態和存活至關重要［37］。自噬已被證實與NLRP3炎癥小體活化密切相關。SAITOH等［38］報道了重要的自噬基因Atg16L1調節內毒素誘導的炎癥小體活化。在LPS刺激的巨噬細胞中，Atg16L1的缺乏可導致NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的產生。自噬誘導劑，如雷帕霉素、二甲雙胍等可激活小膠質細胞的自噬，促進細胞內錯誤折疊的蛋白聚集體的吞噬和降解，從而有效抑制NLRP3炎癥小體的過度活化［39］。

線粒體自噬是一個選擇性去除受損線粒體的過程。一旦發生線粒體功能障礙，線粒體自噬便可以促進線粒體的更新，從而維持線粒體的質量控制。如上所述，大量證據表明受損的線粒體通過多種方式活化NLRP3炎癥小體。因此，線粒體自噬可以被認為是調節NLRP3炎癥小體活化的重要途徑。LI等［40］研究了線粒體自噬的核心參與者Parkin在宿主抗病毒反應中的作用，發現Parkin缺乏通過增強mtROS介導的NLRP3炎癥小體活化來增強先天性抗病毒炎癥并促進病毒清除。此外，PENG等［41］研究發現線粒體自噬誘導劑可以增強清除功能失調的線粒體的能力，從而抑制NLRP3炎癥小體的活化。綜上發現，自噬和線粒體自噬作為一種保護細胞免受過度炎癥的自限性方式，對NLRP3炎癥小體的活化具有負向調節的作用。NLRP3炎癥小體的具體活化和調控過程見圖1。

圖1 NLRP3炎癥小體的活化和調控過程Figure 1 Activation and regulation of NLRP3 inflammasome

2 NLRP3炎癥小體與PSCI的關系

2.1 NLRP3炎癥小體在PSCI中表達量升高 PSCI發病機制復雜，其中炎性反應在其發生中起著關鍵作用［42］。腦卒中發生后，一方面，外周淋巴組織釋放淋巴細胞分泌炎性因子，淋巴細胞及炎性因子侵入大腦，破壞血-腦脊液屏障，造成神經組織損傷；另一方面，腦缺血后釋放趨化因子，促使局部炎性因子和黏附分子等釋放，引發炎性反應，進一步造成神經元的損傷［43］，引起認知功能障礙。NLRP3炎癥小體是腦血管疾病產生的廣泛的復合小體之一，在大腦中大量表達。NLRP3炎癥小體或通過促進腦卒中后的炎性反應引起PSCI的發生，近年來先后有學者從不同層面證實了NLRP3炎癥小體與PSCI的密切關系（表1）。動物實驗顯示，雙側頸總動脈狹窄（BCAS）模型小鼠與假手術組相比，NLRP3炎癥小體在2周和4周顯著增加，且在白質和胼胝體的神經膠質細胞中觀察到免疫反應，與假手術組相比，模型組中IL-18、IL-1β水平明顯升高［44］。同時，通過對HT22細胞進行OGD/R處理構建體外PSCI模型發現，與對照組相比，OGD/R模型NLRP3、ASC、裂解的caspase-1、IL-1β和IL-18水平升高［45］。在臨床研究中，吳金波等［46］為了探究NLRP3與高血壓腦出血患者發生認知功能損害的關系，分別檢測高血壓腦出血發生認知障礙患者與高血壓腦出血未發生認知障礙患者外周血血清中NLRP3 mRNA水平，與對照組相比，發生認知障礙組血清NLRP3 mRNA水平顯著升高。李國麗等［47］比較52例急性缺血性腦卒中后認知障礙患者和61例急性缺血性腦卒中后認知正常患者外周血發現，認知障礙組NLRP3、IL-1β、IL-18水平顯著高于認知正常組。此外，趙鳳華等［48］發現與正常人群的外周靜脈血相比，急性缺血性腦卒中患者的NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表達量更高，且NLRP3炎癥小體的活化程度越高、認知障礙程度越重。

表1 NLRP3炎癥小體在PSCI中表達量升高的相關研究Table 1 Studies on the increased expression of NLRP3 inflammasome in PSCI

2.2 抑制NLRP3炎癥小體改善PSCI的治療方法 鑒于NLRP3炎癥小體在PSCI發病機制中的重要作用，探索其用于改善PSCI的治療方法也成為該領域的熱門話題。大量研究發現，多種藥物及治療措施通過抑制NLRP3炎癥小體的活化來改善PSCI（表2）。

表2 抑制NLRP3炎癥小體改善PSCI的研究Table 2 Studies on inhibition NLRP3 inflammasome to improve PSCI

2.2.1 靶向藥物治療 MCC950是一種選擇性的NLRP3小分子抑制劑，可直接與NLRP3的NACHT結構域中的walker B基序相互作用，阻斷NLRP3 ATPase的活性，使之失去水解ATP的能力，從而阻斷NLRP3寡聚化和形成［49］。通過建立光血栓形成腦卒中小鼠模型，發現MCC950可以通過減少小膠質細胞數量，增加神經元數量，促進海馬神經發生，最終改善PSCI［5］。

鈣調素抑制劑之一的DY-9836被發現可以通過抑制亞硝化應激和NLRP3信號傳導顯著增強認知功能。WANG等［50］使用雙側頸動脈狹窄小鼠模型，分別給予DY-9836（0.5 mg/kg）、DY-9836（1 mg/kg）、納米藥物傳遞系統封裝的DY-9836（0.25 mg/kg）進行干預，結果顯示，DY-9836（1 mg/kg）或納米藥物傳遞系統封裝的DY-9836（0.25 mg/kg）可減輕模型小鼠海馬依賴的空間認知功能障礙，其藥理作用與過氧亞硝酸鹽形成的減少和NLRP3/caspase-1/IL-1β信號傳導的下調相關。

FENG等［51］研究發現在LPS處理的大鼠海馬和小膠質細胞中，NLRP3、caspase-1和促炎細胞因子（IL-1β和IL-18）的表達上調，而miR-138-5p的表達下調，隨后通過預處理補充miR-138-5p可以改善大鼠的神經炎癥和認知功能，得出miR-138-5p與NLRP3的3'-UTR位點之間的特異性相互作用，其中NLRP3是miR-138-5p的直接靶標。

2.2.2 中藥治療 ZHANG等［52］研究發現牡荊素通過 降低 NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-6和裂解的caspase-3的表達來改善永久性雙側頸總動脈閉塞模型小鼠的認知障礙，并通過體外試驗驗證牡荊素能夠抑制NLRP3炎癥小體介導的炎性反應。

Kellerin是一種從傳統中藥阿魏中提取的新型化合物，具有強大的抗神經炎癥作用。通過雙側頸總動脈阻塞建立PSCI小鼠模型，發現Kellerin可以通過抑制NLRP3炎癥小體通路的激活，調節小膠質細胞的極化，從而改善模型小鼠的認知功能［53］。

黃芪甲苷是從中藥材黃芪中分離的主要活性成分，LI等［54］研究發現，黃芪甲苷通過控制ROS的產生來抑制NLRP3炎癥小體活化，降低海馬中小膠質細胞的過度激活和炎性細胞因子的過度表達，通過其抗炎作用對短暫性腦缺血再灌注小鼠發揮改善認知障礙作用。

蛇床子素是來自中藥蛇床子的香豆素類化合物，在不同的動物模型中存在神經保護作用［55］；通過對雙側頸總動脈閉塞誘導的大鼠模型進行研究發現，蛇床子素能夠改善海馬神經元病理損傷，抑制小膠質細胞的活化，并通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減少海馬中的β樣淀粉蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積，最終增強模型大鼠空間學習、記憶和工作能力［56］。

SHI等［57］通過網絡藥理學分析發現，益智通脈湯中的5個核心化合物具有抗血管性癡呆作用，其潛在機制可能是通過抑制NLRP3炎癥小體、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和toll樣受體信號通路改善其認知障礙。隨后，使用分子對接技術將關鍵化合物與NLRP3炎癥小體中的相關蛋白（NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β）對接，發現這些化合物自發地與以上蛋白質結合。但益智通脈湯為成方，組方中的有效成分復雜，在抑制NLRP3炎癥小體活化中具體起作用的成分有待于深入研究。

2.2.3 現代康復 XIA等［58］發現小腦頂核電刺激治療可通過下調NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達，抑制自噬過程和炎性反應，從而減輕神經元的凋亡，改善動脈閉塞法建立模型大鼠的認知障礙。

2.2.4 中醫傳統技術 DU等［59］通過雙側頸總動脈閉塞建立血管性癡呆模型大鼠，發現針刺足三里和百會穴治療可以使模型大鼠海馬神經元丟失和氧化應激減少，硫氧還蛋白相互作用蛋白、NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達降低，從而促進模型大鼠認知功能的恢復。ZHONG等［60］研究表明，電針神庭和百會穴位能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的認知障礙，其通過上調線粒體自噬相關蛋白和抑制腦缺血再灌注損傷后ROS誘導的NLRP3炎癥小體活化發揮神經保護作用。

3 小結與展望

靶向NLRP3炎癥小體可能是PSCI治療的新趨勢。目前為止，盡管許多藥物和治療措施已成功鑒定出能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化，但其臨床中的治療效果和安全性仍有待進一步驗證，因此本文總結歸納的研究也較為有限。在神經系統疾病中，靶向NLRP3炎癥小體的治療藥物的開發還需要通過其在血-腦脊液屏障中的滲透性來評估。更重要的是，在獲得理想治療值的前提下，不會對全身或中樞神經系統產生毒性作用。此外，PSCI是一種慢性進行性疾病，通常需要在早期進行干預。但長期使用炎癥小體靶向藥物是否會影響PSCI患者的健康還需要進一步評估。鑒于中藥和中醫特色療法具有良好的安全性和較小的不良反應，其可能為PSCI的治療提供新的方向。

作者貢獻：李曉曉進行文章的構思、設計與撰寫；王巖進行文獻、資料收集及可行性分析；張雍闖進行文獻、資料的整理與分析；陳淑穎、陳麗敏進行論文修訂；白艷杰負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責。

本文無利益沖突。