LncRNA MCM3AP-AS1調控miR-19b-3p對OGD/R誘導的神經元細胞損傷的影響

江愛民 吳強 陳剛 馬梟 張金武

(1赤壁市人民醫院神經內科，湖北 赤壁 437300；2咸寧市中心醫院神經內科)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中溶栓等治療后的主要并發癥，神經細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷密切相關，當腦組織缺血時炎癥、氧化應激等可促進神經細胞凋亡從而造成腦組織損傷，目前腦缺血再灌注損傷的發生機制尚未完全闡明，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腦缺血再灌注損傷中表達異常并可發揮重要調控作用〔1～4〕。LncRNA MCM3AP-AS1在脂多糖誘導的軟骨細胞中表達水平升高，并可通過調節miR-142-3p/HMGB1促進脂多糖誘導的軟骨細胞凋亡〔5〕。但MCM3AP-AS1在腦缺血再灌注損傷中的表達及其作用機制尚未可知。靶基因預測顯示MCM3AP-AS1與miR-19b-3p存在結合位點，研究表明miR-19b-3p在阿爾茨海默病大鼠中表達水平降低，并可能參與阿爾茨海默病的發生及發展〔6〕。但MCM3AP-AS1與miR-19b-3p在腦缺血再灌注損傷中的作用機制尚未可知。本研究采用氧糖剝奪再復氧(OGD/R)誘導小鼠海馬神經元細胞HT22建立細胞損傷模型，探討MCM3AP-AS1/miR-19b-3p分子軸在OGD/R誘導的神經元細胞損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 小鼠海馬神經元細胞HT22購自上海弘順生物；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-19b-3p購自廣州銳博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒購自上海酶聯生物；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma。

1.2實驗分組 用含94%N2、5%CO2、1%O2的培養箱培養HT22細胞6 h，然后更換為37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養24 h〔7〕，記為OGD/R組。同時將正常培養的細胞作為Con組。si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、si-MCM3AP-AS1與anti-miR-NC、si-MCM3AP-AS1與anti-miR-19b-3p分別轉染入HT22細胞后再進行OGD/R處理，分別記為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-19b-3p組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組。

1.3qRT-PCR檢測細胞中MCM3AP-AS1、miR-19b-3p的表達水平 用Trizol試劑提取各組HT22細胞RNA后將其置于-80℃冰箱內保存。反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，按照熒光定量PCR試劑盒說明書操作并計算目的基因相對表達量。

1.4檢測MDA、SOD水平 采用反復凍融法裂解各組HT22細胞，根據試劑盒說明書分別檢測MDA、SOD水平。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細胞培養上清液，用ELISA檢測TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組HT22細胞加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后將500 μl結合緩沖液加入細胞沉淀，按照試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測MCM3AP-AS1與miR-19b-3p的靶向關系 WT-MCM3AP-AS1、MUT-MCM3AP-AS1分別與miR-NC、miR-19b-3p mimics共轉染入HT22細胞，將其置于培養箱內繼續培養24 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組HT22細胞后加入500 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉2 h，分別加入一抗(美國CST)稀釋液(1∶1 000)與二抗(北京博爾西科技有限公司)稀釋液(1∶2 000)，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1OGD/R誘導的海馬神經元細胞中MCM3AP-AS1與miR-19b-3p的表達量比較 OGD/R誘導的海馬神經元細胞中MCM3AP-AS1表達明顯上調，miR-19b-3p表達明顯下調(均P<0.001)，見表1。

表1 OGD/R誘導的海馬神經元細胞中MCM3AP-AS1與 miR-19b-3p表達量比較

2.2干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥及氧化應激的影響 與Con組比較，OGD/R組MDA、TNF-α、IL-6水平明顯升高，SOD水平明顯降低(P<0.05)；與OGD/R+si-NC組比較，OGD/R+si-MCM3AP-AS1組MDA、TNF-α、IL-6水平明顯降低，SOD水平明顯升高(均P<0.05)，見表2。

表2 干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥、氧化應激及凋亡的影響

2.3干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導的海馬神經元細胞凋亡的影響 與Con組比較，OGD/R組細胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(均P<0.05)，而干擾MCM3AP-AS1可抑制細胞凋亡及Bax表達，并可促進Bcl-2表達(均P<0.05)，見表2、圖1。

2.4MCM3AP-AS1靶向調控miR-19b-3p starBase預測顯示MCM3AP-AS1與miR-19b-3p存在結合位點，見圖2。miR-19b-3p過表達可抑制共轉染野生型載體WT-MCM3AP-AS1細胞的熒光素酶活性(P<0.05)，見表3。

1～4：Con組、OGD/R組、OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1組圖1 干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導的海馬神經元 細胞凋亡的影響

圖2 MCM3AP-AS1的序列中含有與miR-19b-3p 互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告基因實驗

2.5miR-19b-3p過表達對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥、氧化應激及凋亡的影響 miR-19b-3p過表達可明顯降低OGD/R誘導的海馬神經元細胞中MDA、TNF-α、IL-6水平和細胞凋亡率、Bax蛋白水平，而miR-196-3p表達、SOD水平和Bcl-2蛋白水平明顯升高(均P<0.001)，見圖3、表4。

1，2:OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-19b-3p組圖3 miR-19b-3p過表達對OGD/R誘導的海馬神經元 細胞凋亡的影響

表4 miR-19b-3p過表達對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥、氧化應激及凋亡的影響

2.6抑制miR-19b-3p能夠逆轉干擾MCM3AP-AS1表達對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥、氧化應激及凋亡的作用 與OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組比較，OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組MDA、TNF-α、IL-6水平和細胞凋亡率、Bax蛋白水平明顯升高，SOD水平和Bcl-2蛋白水平明顯降低(均P<0.001)，見表5、圖4。

表5 抑制miR-19b-3p能夠逆轉干擾MCM3AP-AS1表達對OGD/R誘導的海馬神經元細胞炎癥、 氧化應激及凋亡的作用

1～2：OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組圖4 抑制miR-19b-3p能夠逆轉干擾MCM3AP-AS1表達 對OGD/R誘導的海馬神經元細胞凋亡的作用

3 討 論

LncRNA在腦缺血再灌注損傷中可發揮重要作用，例如，LncRNA MEG3通過靶向miR-485/AIM2軸而促進神經細胞凋亡從而促進腦缺血再灌注損傷〔8〕。LncRNA SNHG14通過miR-182-5p/BINP3軸誘導吞噬作用而促進OGD/R誘導的海馬神經元細胞損傷〔9〕。LncRNA SNHG12通過抑制miR-199a及上調SIRT1而激活AMPK信號通路從而減輕腦缺血/再灌注損傷〔10〕。

MCM3AP-AS1在慢性阻塞性肺疾病中表達異常并可調控人支氣管平滑肌細胞增殖〔11〕。MCM3AP-AS1在急性缺血性腦卒中表達水平升高，并可能參與急性缺血性腦卒中發生及發展過程〔12〕。MCM3AP-AS1通過調節miR-204-5p/FOXC1促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔13〕。但MCM3AP-AS1在OGD/R誘導的神經元細胞損傷中的表達尚未可知。本研究結果提示MCM3AP-AS1在腦缺血再灌注損傷中可能發揮調控作用，干擾MCM3AP-AS1表達可抑制OGD/R誘導的神經元細胞氧化應激，而干擾MCM3AP-AS1表達可抑制OGD/R誘導的神經元細胞炎癥反應。炎癥或氧化應激誘導的神經細胞凋亡是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，Bcl-2/Bax比值降低可促進細胞凋亡〔14〕。本研究結果顯示，干擾MCM3AP-AS1表達可抑制OGD/R誘導的神經元細胞凋亡。但MCM3AP-AS1調控OGD/R誘導的神經元細胞損傷的分子機制仍需進一步探討。

本研究提示，MCM3AP-AS1可能通過負向調控miR-19b-3p的表達從而發揮作用。研究表明miR-19b-3p通過靶向GRK6降解IL-1β誘導的軟骨細胞外基質降解而減輕細胞炎性損傷〔15〕。腦微血管內皮細胞中miR-19b-3p表達異常可參與腦膜炎性大腸桿菌誘導的神經炎癥反應〔16〕。