紅景天甙調控BDNF/TrkB通路對聽覺剝奪模型大鼠聽皮層可塑性的影響

賈歆 劉強 劉經堯

(1邢臺市人民醫院藥劑科，河北 邢臺 054001；2河北省眼科醫院醫學影像科；3河北醫科大學)

耳聾是臨床常見的耳鼻喉科疾病，藥物、噪音、外傷等是引起耳蝸組織細胞損傷，導致聽覺喪失的主要因素，聽力喪失可極大影響日常交流，給患者正常學習工作造成障礙〔1,2〕。聽覺中樞在聽力受損或恢復時，其神經細胞病理形態會發生改變，被稱作可塑性，藥物、噪音等外界刺激可誘導活性氧(ROS)的大量產生，引發嚴重的過氧化及炎癥反應，造成耳蝸組織結構受損，毛細胞凋亡缺失，進而引起聽皮層可塑性改變，是導致聽覺喪失的主要病理基礎〔2～4〕。腦源性神經生長因子(BDNF)可與受體酪氨酸激酶(Trk)B結合，促進神經元的生長、發育、分化及再生修復，維持突觸的傳遞及可塑性，是保證神經系統正常生理結構及功能的關鍵信號，上調其信號分子表達，可抑制ROS的過量產生，減輕β-淀粉樣蛋白25-35誘導的神經細胞損傷與認知功能障礙，還可延緩耳聾患者聽神經的退化，促使其聽力恢復〔5,6〕，因而BDNF/TrkB信號是改善聽覺喪失患者聽皮層可塑性的潛在作用靶點。紅景天苷是一種酚苷類化合物，大多提取自紅景天屬植物的根、莖，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗炎的功能，能通過清除ROS抑制高糖誘導的應激及炎癥反應，減輕視網膜Müller細胞凋亡，還能顯著減輕噪聲引發的耳蝸外毛細胞損傷，緩解豚鼠聽力損傷癥狀〔7,8〕，但紅景天甙是否可通過調控BDNF/TrkB通路而改善耳聾患者聽皮層可塑性，目前還未可知，本文探討紅景天甙調控BDNF/TrkB通路對聽覺剝奪模型大鼠聽層可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD大鼠63只，體重(200±20)g，生產許可證號SCXK(粵)2018-0043，購自廣州相觀生物科技有限公司。大鼠在本院動物中心進行適應飼養，動物飼養房中溫度(25±2)℃，相對濕度(55±5)%，以12 h/12 h明暗循環進行照明，大鼠自由飲水進食。

1.2主要試劑及儀器 慶大霉素注射液(批號1808183)購自河南潤弘制藥公司；紅景天苷(HPLC≥98%，貨號D0558)購自上海寶曼生物科技有限公司；K252a(貨號HY-N6732)購自美國MedChemExpress公司；活體組織ROS測定試劑盒(貨號HL10016.4)購自上海哈靈生物科技有限公司；OCT包埋劑(貨號4583)購自上海睿鉑賽生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、大鼠白細胞介素(IL)-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒、大鼠干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、兔源腦源性神經營養因子(BDNF)一抗、兔源TrkB一抗、兔源p-TrkB一抗、羊抗兔二抗(貨號分別為ab245880、ab102536、ab213909、ab236712、ab239425、ab181602、ab226843、ab248704、ab197072、ab150077)購自美國Abcam公司；RIPA裂解液(貨號P0013K)購自上海碧云天公司等。

ABR電位儀(型號ICS-CHARTR-EP)，購自北京麥德森醫療器械銷售中心；隔聲屏蔽室購自廣州聲左聲學科技有限公司；掃描電子顯微鏡(型號S-4800)購自日本日立公司；全波長酶標儀(型號HBS-ScanX)購自南京德鐵實驗設備有限公司；冰凍切片機(型號KH-LQ3500)購自湖北孝感闊海醫療科技有限公司；光學顯微鏡(型號E100)購自日本Nikon公司；小型蛋白垂直電泳轉印系統(型號1658033)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(型號GelDoc-It 310)購自上海巴玖實業有限公司等。

1.3聽覺剝奪模型大鼠制備及分組給藥 取SD大鼠63只，檢測大鼠聽覺腦干誘發電位(ABR)閾值，然后以100 mg/kg的劑量肌內注射慶大霉素注射液〔9〕，每天1次，連續注射2 w，再次測定ABR閾值，當其上升20 dB以上時，表示造模成功，共造模51只大鼠，將造模成功48只隨機分為模型組、K252a(BDNF/TrkB通路抑制劑)組、紅景天苷組、紅景天苷+K252a組，每組12只，另取12只大鼠肌內注射等劑量生理鹽水，設為對照組。將紅景天苷、K252a以生理鹽水溶解，配制為10 mg/ml的紅景天苷〔10〕藥液、20 μg/ml的K252a〔11〕藥液、10 mg/ml的紅景天苷及20 μg/ml的K252a混合藥液，給藥組大鼠以5 ml/kg的劑量腹腔注射，對照組與模型組腹腔注射同劑量生理鹽水，每天注射一次，持續21 d。

1.4ABR閾值檢測 以乙醚氣體麻醉大鼠，于其顱頂正中插入記錄電極，于給聲耳、對側耳后皮下分別插入參考電極及接地電極，將大鼠放在隔聲屏蔽室內，以濾波短聲刺激，耳機輸出，距離給聲耳道口0.5 cm，每秒重復10次，頻率100～3 000 Hz，疊加512次，掃描時程10 ms，以Ⅲ波為基準確定記錄反應閾值。

1.5大鼠耳蝸組織病理形態檢測及標本采集 ABR閾值檢測結束后，以注射器自頸動脈處采集血液1.5 ml，離心(4℃，1 000 r/min)，收集上清置于干凈的Ep管中，保存在-80℃冰箱中；通過頸椎脫位處死大鼠，各組隨機選出6只解剖，取出大腦及雙側聽泡，分離出聽皮層及耳蝸組織，各剪下0.5 g保存在液氮中；各組剩余的6只大鼠解剖后取出大腦及雙側聽泡，也分離出聽皮層及耳蝸組織，將大腦聽皮層組織浸入OCT包埋劑中，以液氮快速冰凍后置于冰凍切片機中，做連續病理切片備用，耳蝸組織進行充分灌注固定后，于解剖顯微鏡下仔細解剖、暴露耳蝸各轉螺旋器，以單寧酸導電染色后脫水，經叔丁醇置換后將樣品粘貼在導電膠上，進行離子濺射鍍膜后，以掃描電子顯微鏡觀察耳蝸組織病理形態。

1.6大鼠聽皮層神經元病理形態檢測 取出1.5中的大腦聽皮層切片，浸入冰丙酮中固定后，采用試劑盒進行HE染色，以蒸餾水漂洗后，置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.7大鼠聽皮層及耳蝸組織ROS水平檢測 取出1.5中保存在液氮中的聽皮層及耳蝸組織，加入RIPA裂解液進行勻漿、離心，采集上清液，以BCA檢測試劑盒測定其中蛋白總濃度，取出0.15 ml，采用ROS測定試劑盒測定其中ROS水平，剩余蛋白樣品液保存在-80℃冰箱中。

1.8大鼠血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平檢測 取出1.5中的血清，以冰水浴解凍，采用試劑盒測定其中致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平。

1.9大鼠聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB通路蛋白表達檢測 取出1.7中剩余的蛋白樣品液，以冰水浴解凍，加入適量上樣緩沖液后煮沸變性，每組各取20 μg進行電泳(110 V，90 min)，分離蛋白后濕轉(110 V，90 min)，以5%脫脂奶粉封閉所得聚偏氟乙烯(PVDF)膜上蛋白，根據蛋白分子量截取目的蛋白p-TrkB、TrkB、BDNF、GAPDH條帶，以兔源一抗孵育、洗膜，加入羊抗兔二抗孵育、洗膜，顯色后拍照，通過Image J軟件分析圖片灰度值，進行定量后統計分析出各蛋白相對表達量。

1.10統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組聽力情況比較 與對照組相比，模型組ABR閾值顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組ABR閾值均顯著降低(P<0.05)，K252a組ABR閾值均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組聽皮層及耳蝸組織ROS水平比較 與對照組相比，模型組聽皮層及耳蝸組織ROS水平顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組聽皮層及耳蝸組織ROS水平均顯著降低(P<0.05)，K252a組聽皮層及耳蝸組織ROS水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平比較 與對照組相比，模型組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平均顯著降低(P<0.05)，K252a組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組ABR閾值、聽皮層及耳蝸組織ROS、血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平、p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達

2.4各組耳蝸組織病理改變 對照組耳蝸組織毛細胞形態正常，排列整齊；模型組毛細胞結構改變，大小不一，且排列紊亂，數目缺失，與螺旋神經節細胞周圍突結合發生裂隙，耳蝸組織出現明顯病理損傷；紅景天苷組耳蝸組織病理損傷相比模型組減輕；K252a組耳蝸組織病理損傷相比模型組進一步加重；紅景天苷+K252a組耳蝸組織病理損傷相比模型組無明顯變化。見圖1。

圖1 掃描電鏡觀察各組耳蝸組織病理形態(×3 000)

2.5各組聽皮層神經元改變 對照組聽皮層神經元體積較大，結構形態完好，分布均勻；模型組聽皮層神經元萎縮變小，胞質減少，細胞核出現固縮碎裂，且分布雜亂，數目明顯減少，呈明顯病理損傷；紅景天苷組聽皮層神經元病理損傷相比模型組減輕；K252a組聽皮層神經元病理損傷相比模型組進一步加重；紅景天苷+K252a組聽皮層神經元病理損傷相比模型組無明顯變化。見圖2。

圖2 各組聽皮層神經元病理形態(HE染色，×200)

2.6各組聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB通路蛋白表達比較 與對照組相比，模型組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，K252a組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表1和圖3。

1～5:對照組、模型組、紅景天苷組、K252a組、紅景天苷+K252a組圖3 各組聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB 通路蛋白的免疫印跡檢測

3 討 論

聽力損失是由各種外界有害刺激引發的耳蝸組織及聽皮層神經可塑性損傷，其中氨基糖苷類抗生素暴露是造成耳聾的主要原因〔12,13〕，本文以肌內注射慶大霉素的方法建立聽覺剝奪大鼠模型，結果顯示模型構建成功。氨基糖苷類抗生素可誘導ROS自由基過量產生，引發炎癥反應發生，增強氧化應激，導致耳蝸及聽覺神經損傷，造成聽力喪失，清除ROS，進而降低過氧化反應，抑制炎癥，可防治聽力損失癥狀〔14,15〕。紅景天苷是我國傳統中藥材紅景天的主要有效成分，具有顯著的抗氧化及消炎作用，可抑制永久性大腦中動脈閉塞大鼠神經元凋亡，保護神經功能，還可明顯降低慶大霉素誘導的過氧化反應，減輕耳蝸毛細胞損傷〔16,17〕。本文結果表明紅景天苷可清除慶大霉素暴露誘導產生的ROS，降低致炎細胞因子水平，抑制炎癥，減輕氧化應激，緩解聽皮層神經元與耳蝸組織損傷，改善聽皮層可塑性，提高大鼠聽覺能力，證實了紅景天苷對耳聾的治療作用。

BDNF在突觸可塑性、神經元的發育、再生、修復等方面起到重要的調控作用，可促使下游TrkB蛋白磷酸化，減少ROS、炎性細胞因子合成產生，抑制炎癥進展，降低氧化應激水平，保護神經細胞免于凋亡損傷，維持連接毛細胞的螺旋神經節神經元存活、突起生長及分支，促進其與毛細胞之間的突觸形成，減輕興奮毒素誘導的突觸病變、缺失，促使聽力恢復〔18～20〕，因此，激活BDNF/TrkB信號是防治耳聾的有效手段。本文結果顯示，BDNF/TrkB信號參與聽力喪失過程，紅景天苷可通過激活該信號抑制氧化應激及炎癥反應，

綜上，紅景天苷可上調BDNF蛋白表達，提高TrkB蛋白的磷酸化水平，顯著減少ROS及炎性因子產生，抑制炎癥發生及進展，降低氧化應激水平，減輕聽覺剝奪模型大鼠耳蝸組織損傷，減弱聽皮層神經元變性凋亡，改善聽皮層可塑性，緩解大鼠聽覺喪失癥狀，激活BDNF/TrkB通路是其發揮藥理作用的分子機制之一，本文為紅景天苷在防治耳聾方面的臨床應用及推廣提供了有力證據。