miR-424-5p靶向NUCKS1基因調控子宮內膜癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲

徐旗隅 董惠

(洪湖市人民醫院婦產科，湖北 荊州 433200)

子宮內膜癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一。近年來，由于肥胖癥和代謝性疾病的增加，子宮內膜癌發病率逐年增加，且發病年齡更趨于年輕化〔1〕。子宮切除術聯合放射治療和淋巴結切除術的應用顯著降低了子宮內膜癌的死亡率，但晚期和轉移性子宮內膜癌患者的預后和生存率仍較差〔2〕。因此，闡明子宮內膜癌發生、進展的分子機制、開發有效的治療策略對提高子宮內膜癌患者生存率、改善預后意義重大。微小RNA(miRNA)是進化保守的非編碼小RNA，其通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合調節表達在腫瘤進展中發揮功能作用〔3，4〕。研究顯示，miR-424-5p在子宮內膜癌組織中表達降低，并對子宮內膜癌細胞的生長、遷移轉移具有抑制作用〔5，6〕，然而miR-424-5p在子宮內膜癌中的作用機制并未完全闡明。序列分析發現，miR-424-5p與核酪蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶底物(NUCKS)1之間可能存在相互作用。已有研究證實，宮頸鱗狀細胞癌NUCKS1高表達與腫瘤的進展和復發有關〔7〕。干擾NUCKS1表達顯著降低胃癌細胞的增殖和侵襲性能，并誘導細胞凋亡〔8〕。然而，NUCKS1在子宮內膜癌中的功能及miR-424-5p是否通過調控NUCKS1發揮功能仍未可知。本研究探討miR-424-5p和NUCKS1在子宮內膜癌細胞中表達情況及對宮內膜癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 人子宮內膜癌細胞Ishikawa、HEC-1A、AN3CA及人子宮內膜上皮細胞(hEEC)購自中國科學院上海細胞庫；miR-424-5p模擬物(miR-424-5p mimics)及其對照物(miR-NC)、miR-424-5p抑制物(anti-RNA)及其對照、NUCKS1敲低質粒(si-NUCKS1)及其對照(si-NC)、NUCKS1過表達質粒(pcDNA-NUCKS)及其對照物(pcDNA-NC)購自上海吉瑪制藥公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒、miRNA第一鏈合成試劑盒、SYBR-Green Premix購于大連寶生物工程公司；凋亡試劑盒購于上海貝博生物；抗體NUCKS1、細胞周期素(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9和裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、β-actin抗體等一抗及山羊抗兔IgG二抗購于上海賽信通公司。

1.2細胞培養 Ishikawa、HEC-1A、AN3CA細胞均使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基培養于37℃含5%CO2的恒溫培養箱中，當細胞密度達到85%時進行消化傳代，每周更換2次培養液。取2×105個對數期Ishikawa細胞接種6孔板培養24 h后，通過脂質體轉染將miR-NC、miR-424-5p mimics、si-NC、si-NUCKS1、pcDNA-NC、pcDNA-NUCKS1、miR-424-5p+pcDNA-NC、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1分別轉染至Ishikawa細胞，分為miR-NC組、miR-424-5p mimics組、si-NC組、si-NUCKS1組、pcDNA-NC組、pcDNA-NUCKS1組、miR-424-5p+pcDNA-NC組、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組。同時未轉染為對照(NC)組。轉染48 h時收集細胞實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)和Western印跡檢測轉染效果，隨后進行下一步實驗。

1.3RT-qPCR檢測miR-424-5p和NUCKS1 mRNA表達 通過Trizol試劑提取細胞中的總RNA，并檢測RNA的濃度和純度。利用PrimeScript逆轉錄試劑盒、miRNA第一鏈合成試劑盒分別合成mRNA和miRNA的cDNA。利用SYBR-Green Premix和特定的PCR引物進行RT-qPCR。以β-actin或U6作為內參基因，通過使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。PCR引物序列：miR-424-5p：上游5′-GGCTAGTCAGCAGCAATTCATGT-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；NUCKS1：上游5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游5′-GACCCTTCATCCC-CAGATTT-3′；內參β-actin：上游5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′。

1.4CCK-8法檢測細胞活力 將各組細胞接種到96孔板中，孵育細胞24 h后加入10 μl的CCK-8試劑，培養箱中繼續孵育2 h后通過酶標儀測定450 nm吸光度值(A)檢測其細胞活力。

1.5Transwell法檢測細胞遷移和侵襲 將Transwell室放置在24孔板中。每組取1×105個細胞(200 μl不含血清DMEM培養基稀釋)接種在Transwell小室上腔，下腔加入600 μl含10% FBS的培養基。孵育24 h后，取出小室，除去Transwell膜上非遷移細胞后用甲醇固定、結晶紫染色，通過計數顯微鏡下隨機5個視野遷移細胞數的平均值來檢測其遷移能力。侵襲實驗中除Transwell小室預先被基質膠包被外，剩余步驟同遷移實驗。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞使用500 μl的結合緩沖液重懸，使密度達到1×105個/ml。分別加入5 μl的膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，在室溫下避光孵育25 min，冰上孵育，1 h內上機檢測凋亡水平。

1.7Western印跡檢測細胞內目的蛋白表達 向收集的細胞中加入含蛋白酶抑制劑和蛋白酶磷酸化抑制劑的裂解緩沖液，于冰上孵育裂解細胞收集含總蛋白的上清液，并通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量測定其濃度。將蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉膜、封閉后，用兔抗NUCKS1、CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3抗體于室溫條件下孵育膜1 h進行抗原-抗體反應，再加入山羊抗兔IgG二抗，將膜在室溫孵育1 h后進行顯影，之后分析目的條帶灰度值，通過計算目的蛋白與內參β-actin的相對表達量來檢測其表達水平。

1.8雙熒光素酶報告實驗 Starbase預測顯示NUCKS1 mRNA的3′-UTR區域含有的互補序列，將含有miR-424-5p結合位點的野生(WT)NUCKS1 mRNA-3′-UTR序列或突變(MUT)系列插入到熒光素酶報告質粒獲得熒光素酶報告載體。將上述兩個插入后的報告載體(WT-NUCKS1、MUT-NUCKS1)與miR-424-5p mimics、miR-NC分別共轉染Ishikawa細胞48 h后檢測細胞相對熒光素酶活性。同時將miR-424-5p mimics、miR-NC、anti-miR-424-5p、anti-miR-NC分別轉染Ishikawa細胞48 h后檢測NUCKS1蛋白表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS25.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1子宮內膜癌細胞系miR-424-5p和NUCKS1的表達情況 與hEEC細胞相比，子宮內膜癌細胞(Ishikawa、HEC-1A、AN3CA)中的miR-424-5p表達水平明顯降低，而NUCKS1 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1。選取miR-424-5p表達較低、NUCKS1表達較高的Ishikawa細胞進行后續實驗。

2.2過表達miR-424-5p對Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與NC組和miR-NC組比較，過表達miR-424-5p后可顯著抑制Ishikawa細胞的A值、遷移和侵襲水平，并明顯降低CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達，明顯增加細胞凋亡水平及相關蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(均P<0.05)。見圖2、圖3、表2。

表1 子宮內膜癌細胞系中miR-424-5p和 NUCKS1的表達

圖1 Western印跡檢測NUCKS1蛋白表達

2.3抑制NUCKS1表達對Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，沉默NUCKS1后可顯著抑制Ishikawa細胞的A值、遷移和侵襲水平，并明顯降低NUCKS1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達，明顯增加細胞凋亡水平及相關蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(P<0.05)。見表3、圖4。

圖2 Transwell檢測細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

1～3：NC組、miR-NC組、miR-424-5p組 A：各組細胞凋亡水平；B：Western印跡檢測Ishikawa細胞內CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3蛋白表達圖3 過表達miR-424-5p對Ishikawa細胞增殖、凋亡的影響

表2 過表達miR-424-5p對Ishikawa細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡水平的影響

表3 抑制NUCKS1表達對Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測Ishikawa細胞中NUCKS1、 CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3蛋白表達

2.4miR-424-5p靶向調控NUCKS1表達 從Starbase分析結果(圖5A)可知，NUCKS1的3′端和miR-424-5p的5′端存在部分的互補結合位點。將miR-424-5p mimics和WT-NUCKS1共轉染至Ishikawa細胞后，其相對熒光素酶活性(0.48±0.04)與miR-NC和WT-NUCKS1共轉染(1.00±0.11)比較顯著降低(P<0.05)；將miR-424-5p mimics和MUT-NUCKS1共轉染至Ishikawa細胞后，其相對熒光素酶活性(1.02±0.09)與miR-NC和MUT-NUCKS1共轉染(1.04±0.10)比較無顯著變化(P>0.05)。miR-424-5p組Ishikawa細胞中NUCKS1蛋白表達水平(0.42±0.04)與miR-NC組(0.82±0.08)比較顯著降低(P<0.05)；anti-miR-424-5p組Ishikawa細胞中NUCKS1蛋白表達水平(1.11±0.10)與anti-miR-NC組(0.84±0.07)比較顯著升高(P<0.05)。見圖5B。

A：starbase對NUCKS1和 miR-424-5p結合進行預測；B：Western印跡檢測NUCKS1蛋白的表達；1～4：miR-NC組、miR-424-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-424-5p組圖5 miR-424-5p靶向NUCKS1調控NUCKS1的表達

2.5過表達NUCKS1可以逆轉miR-424-5p過表達對Ishikawa細胞增殖、遷移和侵襲并誘導細胞凋亡 與pcDNA-NC組細胞相比，pcDNA-NUCKS1可顯著增強Ishikawa細胞中A值、遷移和侵襲能力，顯著升高細胞中NUCKS1、CyclinD1及遷移和侵襲相關蛋白MMP2和MMP9表達，顯著降低細胞凋亡水平及其相關蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(P<0.05)；與miR-424-5p+pcDNA-NC組比較，miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組可顯著增強Ishikawa細胞中A值、遷移和侵襲能力，顯著升高細胞中NUCKS1、CyclinD1及遷移和侵襲相關蛋白MMP2和MMP9表達，顯著降低細胞凋亡水平及其相關蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(P<0.05)。見圖6、表4。

1～4：pcDNA-NC組、pcDNA-NUCKS1組、miR-424-5p+pcDNA-NC組、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組圖6 Western印跡檢測NUCKS1、CyclinD1、MMP2、 MMP9、MRP1蛋白表達

表4 過表達NUCKS1可以逆轉miR-424-5p過表達對Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

3 討 論

越來越多研究發現miRNA可以調控腫瘤相關基因的表達，在各種生物學過程中發揮重要作用，包括細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成及耐藥性〔9，10〕。探討miR-424-5p在子宮內膜癌進展中的作用和機制，有望為子宮內膜癌治療提供有效靶點。

本研究通過RT-qPCR檢測miR-424-5p表達發現，子宮內膜癌細胞中miR-424-5p表達水平顯著降低，與Li等〔5〕研究結果相吻合。CyclinD1是參與細胞周期轉換的關鍵蛋白，CyclinD1表達增加促進細胞周期向S期轉換具有促增殖作用〔11〕。大量研究證實，MMP-2和MMP-9與癌癥的發生和發展密切相關，其參與細胞外基質的降解，是腫瘤侵襲轉移過程中的關鍵調節劑〔12〕。本研究結果表明，miR-424-5p在子宮內膜癌中具有抑癌作用，過表達miR-424-5p可有效降低子宮內膜癌細胞的惡性生物學行為。與本研究結論類似，Piao等〔13〕指出肝癌細胞中miR-424-5p呈較低的表達水平，通過轉染將miR-424-5p過表達后可誘導肝癌細胞的凋亡并降低其增殖能力。Wu等〔14〕證實miR-424-5p對肝內膽管癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質轉化進程具有抑制作用。

目前，NUCKS1已被證實與多種癌癥類型中發揮作用。結腸癌中NUCKS1高表達與總體存活率和無復發生存率顯著降低有關〔15〕。肝癌中敲減NUCKS1可降低肝癌細胞活力，抑制異種移植小鼠模型腫瘤形成〔16〕。此外，有研究證實miR-142-3p通過靶向下調NUCKS1可抑制胰腺癌細胞的生物學行為〔17〕。本研究發現，宮頸癌細胞中NUCKS1在mRNA和蛋白水平表達均顯著升高，抑制NUCKS1表達與過表達miR-424-5p對Ishikawa細胞的增殖能力、遷移、侵襲和凋亡具有相同的作用，而轉染pcDNA-NUCKS1過表達NUCKS1則具有相反的作用。進一步分析發現，miR-424-5p直接結合NUCKS1并負調控NUCKS1表達。此外，過表達NUCKS1顯著逆轉miR-424-5p過表達對Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的抑制作用。提示靶向負性調控NUCKS1表達是miR-424-5p在子宮內膜癌中發揮作用的重要機制。

綜上，miR-424-5p通過靶向NUCKS1可抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。