葛花總黃酮通過TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕糖氧剝奪對人腦血管內皮細胞損傷的機制

陳夢宇 張金武 杜杰 肖騁

(咸寧市中心醫院 湖北科技學院附屬第一醫院神經內科，湖北 咸寧 437000)

腦卒中又稱為“中風”，是臨床上常見的一種急性腦血管疾病，由于腦部血管裂開或阻塞導致的血液不能正常流入大腦組織引起腦組織損傷，引起缺血性或出血性腦卒中，其發病率、死亡率和致殘率較高，是威脅患者生命健康安全的頭號殺手〔1〕。葛花是豆科野葛或甘葛藤的花，主要生產地集中在河南、四川、廣東、浙江和安徽等地，常用于治療解酒醒脾、不思飲食、吐血、狀熱、頭暈等癥狀〔2～4〕。葛花具有降低血糖、抗炎和抗腫瘤等功效，黃酮類是葛花含量較高的活性成分〔5〕，葛花總黃酮(TFG)減緩小鼠腦組織的炎癥反應，抑制神經細胞凋亡，減緩腦部缺血再灌注損傷，對腦組織起到保護作用〔6〕，但是對糖氧剝奪(OGD)誘導人腦血管內皮細胞的研究尚不明確。Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化的初級應答(MyD88)/核因子(NF)-κB通路是參與炎癥反應的經典通路，與多種疾病的發展密切相關〔7〕。張業昊等〔8〕研究結果顯示，黃芩苷通過調控TLR4/NF-κB信號通路減緩缺氧復氧誘導人腦微血管內皮細胞(HBMEC)炎性損傷。本研究探討TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕OGD對人腦血管內皮細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 HBMEC購于美國ATCC公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司；高糖DMEM培養基、DMEM培養基購于美國Gibco BRL公司；TFG(含量50.57%)購于南京澤朗醫藥公司；pcDNA、TLR4購于上海吉瑪公司；Lipofectamine2000試劑盒購于美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)試劑盒、凋亡試劑盒購于北京索萊寶公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)抗體、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved cas)3抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、p-NF-κB抗體、NF-κB抗體、GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體購于北京中山金橋公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購于南京建成生物研究所。

1.2細胞培養和分組 復蘇HBMEC在含有10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養基內，并在條件為37℃、5% CO2培養箱中進行培養。觀察細胞的生長狀態，待細胞生長至80%時，加入胰酶消化，每2 d換1次培養基。

取對數生長期的HBMEC接種在96孔板中，沖洗2次更換為無糖培養基，然后將細胞培養板放置在95%N2、5%CO2培養中培養6 h，建立OGD細胞模型，將細胞分為對照(Control)組、OGD模型(OGD)組、OGD模型+TFG低、高劑量(OGD+TFG-L、OGD+TFG-H)組、OGD+TFG+pcDNA組和OGD+TFG+TLR4組。Control組在正常條件下培養，不做任何處理，其余5組進行OGD處理，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組：TFG低、高劑量濃度為10、100 mg/L處理；OGD+TFG+pcDNA組、OGD+TFG+TLR4組：將pcDNA、TLR4轉染至細胞，并采用濃度為100 mg/L TFG處理。細胞轉染時采用Lipofectamine2000試劑盒說明書進行。

1.3MTT檢測細胞活力 取1.2各組HBMEC調整密度為5.0×104/ml，并接種在96孔板中，在37℃、5% CO2培養箱固定培養48 h，然后在每孔內加入20 μl的MTT試劑，繼續培養4 h，在每孔內加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)試劑，結晶充分溶解后，在酶標儀490 nm處檢測細胞吸光度值，計算細胞活力。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取1.2各組HBMEC培養48 h后，采用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，按照凋亡試劑盒說明書步驟，分別加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)試劑10 μl，再加入碘化丙啶(PI)試劑5 μl，在暗室中反應15 min，1 h內在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.5Western印跡檢測Bax、Cleaved cas3和TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白表達 取1.2各組HBMEC提取總蛋白后，按照二喹啉甲酸(BCA)法檢測定量蛋白。取45 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉培養2 h，加入一抗Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB和GAPDH，4℃過夜培養，加入HRP標記的IgG抗體，室溫培養2 h，加入發光液顯影、曝光。Quantity One軟件掃描蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算分析目的蛋白表達。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表達 取1.2各組HBMEC，PBS清洗2遍，裂解震蕩，離心后收集細胞上清液，按照SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α試劑盒說明書，檢測SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表達。

1.7統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1TFG對OGD誘導HBMEC增殖和凋亡的影響 與Control組相比，OGD組細胞活力顯著降低，細胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達顯著增加(均P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組細胞活力顯著增加，細胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 TFG對OGD誘導HBMEC凋亡的影響

1～4:Control組、OGD組、OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組圖2 Western印跡檢測相關蛋白表達

表1 TFG對OGD誘導HBMEC增殖和 凋亡的影響

2.2TFG對OGD誘導HBMEC氧化應激的影響 與Control組相比，OGD組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3TFG對OGD誘導HBMEC炎癥反應的影響 與Control組相比，OGD組IL-6、IL-10、TNF-α表達顯著升高(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組IL-6、IL-10、TNF-α表達顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4TFG對OGD誘導HBMEC TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響 與Control組相比，OGD組TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表2 TFG對OGD誘導HBMEC氧化應激、炎癥反應、TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

表3 TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導HBMEC增殖、凋亡、氧化應激和炎癥反應的影響

2.5TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導HBMEC增殖、凋亡的影響 與OGD+TFG+pcDNA組相比，OGD+TFG+TLR4組細胞活力顯著降低，TLR4蛋白表達、細胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4、圖5。

2.6TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導HBMEC氧化應激和炎癥反應的影響 與OGD+TFG+pcDNA組相比，OGD+TFG+TLR4組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，IL-6、IL-10、TNF-α表達顯著升高(P<0.05)。見表3。

1～4:Control組，OGD組，OGD+TFG-L組，OGD+TFG-H組圖3 TFG對OGD誘導HBMEC TLR4/ MyD88/NF-κB通路的影響

圖4 葛花總黃酮通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對 OGD誘導HBMEC凋亡的影響

1～2:OGD+TFG+pcDNA組，OGD+TFG-TLR4組圖5 Western印跡檢測TLR4、Bax、 Cleaved cas3蛋白表達

3 討 論

腦卒中是腦部血管疾病常見的疾病，大約占全部腦血管疾病的70%，目前關于治療腦卒中尚無有效的方法〔9〕。腦血管內皮細胞缺氧或缺血能夠促進炎癥因子的分泌、促進細胞氧化自由基損傷，因此，如何改善腦血管內皮細胞功能紊亂引起的腦卒中至關重要〔10，11〕。葛花作為中國的傳統醫藥，具有多種活性成分，如黃酮類、揮發油類和皂苷類等〔12，13〕。康樂等〔14〕研究結果顯示，TFG可以減緩大鼠局灶性腦缺血再灌注炎性反應，保護腦組織免受損傷。TFG能夠減低胰島素抵抗，改善大鼠的認知功能，減緩大鼠海馬神經元的炎性損傷〔15〕。本研究結果說明，TFG可以抑制OGD誘導HBMEC的凋亡、氧化應激和炎癥反應，并促進細胞增殖。

TLR4是一種跨膜蛋白，廣泛存在各種細胞內，能夠識別病原分子引起炎癥反應，且活化的TIR結構域激活MyD88依賴性途徑，引起NF-κB被活化〔16，17〕。研究發現，TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達在小鼠膠質細胞中表達下調，利用siRNA干擾技術，發現TLR4 siRNA抑制小鼠膠質細胞的自噬和腦部出血引起的炎性損傷〔18〕。韓晨陽等〔19〕研究顯示，丁苯酚通過抑制抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路減緩糖氧剝奪導的HBMEC的炎癥反應和細胞凋亡。本研究結果說明，TFG可以調控TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達。在HBMEC轉染TLR4后，結果發現，過表達TLR4可以抑制OGD誘導HBMEC的增殖，促進細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應，說明TFG通過調控TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕OGD誘導HBMEC損傷。