溫陽(yáng)逐瘀湯對(duì)腎陽(yáng)虛腦缺血損傷大鼠SDF-1、CXCR4表達(dá)的影響

韋亮 祝美珍 孫詩(shī)杰 蘇萍 何宏盾

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000)

腦缺血損傷又稱(chēng)缺血性腦卒中(ICVD)，是由于各種原因引起腦血管梗死不通，局部腦組織缺血缺氧進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等一系列病理過(guò)程，出現(xiàn)偏癱、失語(yǔ)等神經(jīng)功能缺損癥狀，甚至危及生命〔1〕。ICVD是我國(guó)最常見(jiàn)的腦卒中類(lèi)型，其發(fā)病率高、致死致殘率高，占我國(guó)腦卒中發(fā)病類(lèi)型的69.6%～70.8%〔2〕。腦缺血發(fā)生后，及早地再灌復(fù)流是治療ICVD的重點(diǎn)與關(guān)鍵〔3〕。加快側(cè)支循環(huán)的建立可改變血流通過(guò)路徑并提供反向血流灌注，增加血液灌注，保持腦血容量，改善腦缺血癥狀〔4〕。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1/CXC趨化因子受體(CXCR)4信號(hào)通路，被認(rèn)為是能激活一條細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞遷移的信號(hào)通路，可以調(diào)節(jié)造血細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等多種細(xì)胞的遷移、分化、增殖及神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)行為〔5〕，從而促進(jìn)新的血管生成，增加腦血流量的灌注，改善腦損傷，起到腦保護(hù)的作用。干預(yù)和調(diào)控SDF-1、CXCR4的表達(dá)水平，可使SDF-1/CXCR4信號(hào)通路發(fā)揮其最大的生物學(xué)效應(yīng)。本研究根據(jù)ICVD“腎陽(yáng)不足-痰瘀互結(jié)-痹阻腦絡(luò)”的重要病機(jī)鏈鎖，基于ICVD的證候病機(jī)與分子病理，研究溫陽(yáng)逐瘀湯對(duì)腎陽(yáng)虛ICVD大鼠側(cè)支循環(huán)建立相關(guān)指標(biāo)SDF-1、CXCR4表達(dá)的影響，探索其促進(jìn)腦缺血組織側(cè)支循環(huán)建立的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥防治ICVD提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 192只SPF級(jí)SD雄性大鼠，鼠齡3～4個(gè)月，體重(250±25)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYSK桂2014-0003。

1.2藥物 溫陽(yáng)逐瘀湯：制附子10 g、肉桂5 g、杜仲15 g、巴戟天15 g、當(dāng)歸10 g、熟地20 g、桃仁10 g、紅花10 g、水蛭8 g、姜半夏9 g、南山楂15 g、紅參10 g；每劑含137 g生藥，藥材購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；氫化可的松注射液，福安藥業(yè)集團(tuán)湖北人民制藥有限公司，市售，批號(hào)H20058654。

1.3儀器及試劑 超低溫冰箱(澳柯瑪)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司)、垂直電泳儀(美國(guó) BIO-RAD)、全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(瑞士 LightCycler96)、酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢基因美，生產(chǎn)批號(hào)：GR2020-05)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒〔北京索萊寶，貨號(hào)：PC0020-500微孔(50T)〕、高效 RIPA 裂解液(北京索萊寶，貨號(hào)：R0010-100ml)、預(yù)染彩虹蛋白marker〔北京索萊寶，貨號(hào)：PR1910-50T(250 μl)〕、山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(北京中杉金橋)、TRIZOL裂解液(美國(guó)Invitrogen)、SDF-1、CXCR4單克隆抗體(英國(guó) abcam 公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(莫納生物科技有限公司)、擴(kuò)增試劑盒(莫納生物科技有限公司)、SDF-1和CXCR4引物及內(nèi)參(上海生工股份有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司) 。

1.4動(dòng)物分組 將192只成年健康雄性SD大鼠按體重進(jìn)行分層及編號(hào)，使用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)分組，先分為空白組48只和腎陽(yáng)虛模型組144只，腎陽(yáng)虛模型組肌肉注射氫化可的松注射液21 d后，建立腎陽(yáng)虛模型，再將造模成功后的144只腎陽(yáng)虛模型大鼠按體重進(jìn)行隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、模型組、溫陽(yáng)逐瘀湯組，每組各48只。

1.5模型制備

1.5.1腎陽(yáng)虛模型 空白組正常喂養(yǎng)，腎陽(yáng)虛模型組連續(xù)21 d早8∶00～9∶00進(jìn)行腿部肌肉注射氫化可的松注射液，25 mg/kg〔6〕，自由飲食、飲水。每日造模前后測(cè)量觀察各組大鼠的體重、進(jìn)食量、飲水量、一般狀態(tài)及二便并記錄。

1.5.2ICVD模型 將完成腎陽(yáng)虛造模后的模型組、溫陽(yáng)逐瘀湯組大鼠用10%水合氯醛麻醉后，參考Longa等〔7〕法制成大鼠急性ICVD模型。假手術(shù)組線栓插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻斷大腦中動(dòng)脈血流。參考 Longa〔7〕的評(píng)分法對(duì)造模后大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分篩選出符合要求的ICVD模型。

1.6藥物干預(yù) 以體重60 kg成人每天服用溫陽(yáng)逐瘀湯，參考《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》〔8〕中的標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行換算，按體量1 ml/100 g進(jìn)行灌胃；分別于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00時(shí)進(jìn)行灌胃，空白組、假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，溫陽(yáng)逐瘀湯組予以溫陽(yáng)逐瘀湯灌胃，藥物濃度含生藥材2 g/ml，直至各時(shí)間點(diǎn)取材。

1.7標(biāo)本采集及處理 ①采血：對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈采血1 ml，用含肝素鈉采血管收集，置數(shù)小時(shí)后取血清，3 000 r/min離心10 min，-80℃保存；②取腦：使用10%水合氯醛麻醉后進(jìn)行取腦，將用于HE檢測(cè)的腦組織浸于4%的多聚甲醛，而用于Western檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)的腦組織放入-80℃冰箱凍存。

1.8檢測(cè)方法 ①采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)腎陽(yáng)虛證模型造模后及灌胃后的腎陽(yáng)虛特異性指標(biāo)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)；②采用Western印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)腦組織SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平；③HE染色法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)缺血損傷側(cè)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量資料方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1腎陽(yáng)虛模型癥狀及指標(biāo)

2.1.1癥狀及體征 空白組大鼠始終保持皮毛光澤，反應(yīng)敏捷，二便正常；腎陽(yáng)虛模型組大鼠從7 d開(kāi)始出現(xiàn)皮毛色澤暗淡、枯槁欠光亮，體毛疏松，輕微脫毛現(xiàn)象，倦怠萎靡，懶動(dòng)喜臥，行動(dòng)緩慢，大便質(zhì)軟；14 d后出現(xiàn)豎毛，脫毛明顯，反應(yīng)遲鈍，畏冷蜷縮，弓背瞇眼，陰囊皺縮，睪丸回升，飲食減少，小便頻數(shù)，大便稀溏等癥狀；21 d后上述癥狀加重；與空白組相比，腎陽(yáng)虛模型組大鼠體重呈緩慢增長(zhǎng)，14 d、21 d明顯下降(P<0.01)，提示腎陽(yáng)虛模型造模成功，見(jiàn)表1。

2.1.2腎陽(yáng)虛證特異性指標(biāo)cAMP、cGMP水平的變化 與空白組比較，腎陽(yáng)虛模型組血清cAMP水平明顯降低，cGMP水平明顯升高，cAMP/cGMP比值明顯降低(P<0.01)，提示腎陽(yáng)虛模型造模成功，見(jiàn)表1。

表1 空白組和腎陽(yáng)虛模型組不同時(shí)間點(diǎn)體重及cAMP、cGMP比較

2.2大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 空白組與假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能表現(xiàn)正常。同一時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比，模型組和溫陽(yáng)逐瘀湯組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，溫陽(yáng)逐瘀湯組在各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示ICVD模型成功，見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較分)

2.3各組缺血側(cè)腦組織病理 空白組、假手術(shù)組：細(xì)胞排列規(guī)整，胞膜完整，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；模型組：細(xì)胞排列紊亂稀疏，大量細(xì)胞壞死，呈明顯的缺血性損害改變；溫陽(yáng)逐瘀湯組：細(xì)胞排列稀疏紊亂，但與模型組相比較為整齊，部分細(xì)胞壞死，呈三角形收縮并深染，胞膜消失，核仁呈紫藍(lán)色，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；隨著灌胃給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，與模型組相比，溫陽(yáng)逐瘀湯組細(xì)胞明顯逐漸增多，胞膜相對(duì)完整，胞質(zhì)呈淺紫色，胞核逐漸清晰可見(jiàn)，見(jiàn)圖1。

2.4各組大鼠腦組織SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 同一取材時(shí)間點(diǎn)相比，空白組、假手術(shù)組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組、溫陽(yáng)逐瘀湯組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；模型組、溫陽(yáng)逐瘀湯組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)水平均于7 d達(dá)到峰值，14、21 d表達(dá)逐漸下降，且SDF-1與CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)趨勢(shì)相同；同一取材時(shí)間點(diǎn)相比，溫陽(yáng)逐瘀湯組SDF-1與CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示溫陽(yáng)逐瘀湯可明顯上調(diào)SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達(dá)水平，見(jiàn)表3、圖2、表4。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)水平

1～4:空白組，假手術(shù)組，模型組，溫陽(yáng)逐閼湯組

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SDF-1、CXCR4 mRNA相對(duì)量表達(dá)水平比較

3 討 論

ICVD發(fā)生后，盡早恢復(fù)缺血灶的血流量是治療的重要切入點(diǎn)，也是降低的致殘率、致死率的關(guān)鍵。臨床研究結(jié)果表明，ICVD發(fā)生后，隨著側(cè)支循環(huán)的開(kāi)放，患者發(fā)生腦梗死的數(shù)量及梗死面積顯著減少，可明顯降低ICVD的復(fù)發(fā)率〔9,10〕。研究證實(shí)，ICVD大鼠缺血側(cè)腦組織中SDF-1及CXCR4的含量顯著高于對(duì)側(cè)未受損腦組織〔11〕。以SDF-1、CXCR4為主要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，在治療腦缺血損傷中發(fā)揮著重要的作用，其主要作用機(jī)制大致可分為以下三方面：①誘導(dǎo)干細(xì)胞和內(nèi)源性祖細(xì)胞通過(guò)增加的梗死周?chē)腟DF-1和表達(dá)CXCR4來(lái)上調(diào)營(yíng)養(yǎng)因子〔12〕。②調(diào)動(dòng)內(nèi)皮祖細(xì)胞等促進(jìn)血管新生:被釋放的SDF-1可以促進(jìn)成熟或未成熟的造血細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞前體細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞等促進(jìn)血管細(xì)胞的生成，恢復(fù)缺血組織的血流灌注；而CXCR4也可以直接或間接地生成這些促血管生成細(xì)胞，從而一同達(dá)到血管新生的目的〔13,14〕。③提高機(jī)體抗缺氧能力〔15〕。

SDF-1屬于趨化因子蛋白家族中的一員，可作為趨化細(xì)胞因子參與細(xì)胞活化、分化和運(yùn)輸〔16〕。SDF-1在缺血灶中表達(dá)的上調(diào)主要是從損傷后3 d開(kāi)始，于7 d達(dá)到高峰，且能持續(xù)表達(dá)至30 d〔17〕。SDF-1有CXCR7、CXCR4兩大受體，但CXCR7是通過(guò)CXCR4才能發(fā)揮對(duì)SDF-1進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，所以認(rèn)為CXCR4是SDF-1的唯一特異性受體〔18〕。CXCR4作為一類(lèi)G蛋白耦聯(lián)受體，它由7個(gè)疏水性跨膜區(qū)組成，能表達(dá)于不同細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中，能正向誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞向組織損傷處遷移及歸巢，在受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)上起到關(guān)鍵作用。

腦卒中多發(fā)于中老年人，其病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)。中醫(yī)認(rèn)為，腎為五臟六腑之本，腎氣為元?dú)庵Ｄ昀夏I虛，氣虛無(wú)力暢行血脈，陽(yáng)虛無(wú)力溫化津血，則痰瘀內(nèi)生，痹阻腦脈而發(fā)為腦卒中。“腎陽(yáng)不足-痰瘀互結(jié)-痹阻腦絡(luò)”是ICVD的主要病機(jī)，治宜謹(jǐn)守病機(jī)，無(wú)失氣宜，以溫陽(yáng)通脈、逐瘀通絡(luò)為法。一則溫補(bǔ)腎陽(yáng)、逐瘀通脈恢復(fù)局部缺血腦組織的血液供應(yīng)，挽救缺血半暗帶組織；二則溫補(bǔ)腎陽(yáng)，化瘀生新，促進(jìn)血管新生，建立側(cè)支循環(huán)，進(jìn)一步恢復(fù)腦部血流，改善腦缺血損傷預(yù)后、實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)。

溫陽(yáng)逐瘀湯方中以附子、肉桂共為君藥，同歸腎經(jīng)，共奏補(bǔ)火助陽(yáng)、溫腎固本之效；臣以杜仲、巴戟天、紅參補(bǔ)腎助陽(yáng)、益氣培元，共助君藥溫補(bǔ)腎陽(yáng)；佐以熟地滋陰活血、亦有陰中求陽(yáng)之意；當(dāng)歸、桃仁、紅花、水蛭補(bǔ)血活血、逐瘀通經(jīng)；半夏、山楂行氣化痰。全方溫補(bǔ)腎陽(yáng)、化痰逐瘀，切斷ICVD“腎陽(yáng)不足-痰瘀互結(jié)-痹阻腦絡(luò)”的病機(jī)鏈鎖，獲得“溫腎陽(yáng)-祛痰瘀-生新絡(luò)”的治療效應(yīng)。

本研究結(jié)果證明，溫陽(yáng)逐瘀湯可明顯改善腎陽(yáng)虛ICVD大鼠畏寒蜷縮、四肢冰涼、大便稀溏、體質(zhì)量下降等的陽(yáng)虛表征及腎陽(yáng)虛證特異性指標(biāo)，可能系方中附子、肉桂、杜仲等歸腎經(jīng)的溫陽(yáng)藥，共奏溫腎固本之效，改善了大鼠腎陽(yáng)虛證的癥狀；實(shí)驗(yàn)灌胃溫陽(yáng)逐瘀湯后，腎陽(yáng)虛ICVD大鼠缺損的神經(jīng)功能與模型組相比得以良好的改善，缺血組織腦細(xì)胞損傷程度明顯減輕，可能系方中當(dāng)歸、紅花、桃仁、半夏等活血、化痰、祛瘀之品，復(fù)通腦脈，增加了缺血的腦組織的血流灌注量，從而修復(fù)損傷的腦細(xì)胞及神經(jīng)功能；大鼠腦組織SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，可能系全方在溫補(bǔ)腎陽(yáng)、逐瘀化痰的基礎(chǔ)上，活血生脈，導(dǎo)致參與血管新生因子表達(dá)上調(diào)，從而增加損傷區(qū)域的腦血流灌注量。

綜上所述，溫陽(yáng)逐瘀湯可以明顯改善腎陽(yáng)虛型ICVD大鼠的腎陽(yáng)虛表現(xiàn)，降低ICVD大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分,其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)缺血側(cè)腦組織中的SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)缺血損傷局部血管新生，改善ICVD的神經(jīng)功能損傷，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)，從而發(fā)揮其防治ICVD的作用。