裸花紫珠調控IGF-1/PI3K/Akt信號通路對糖尿病足潰瘍大鼠創面愈合的影響

李吉慶 林道斌 張永杰 陳學武

(廣州中醫藥大學附屬海南省中醫院內分泌科，海南 海口 570200)

糖尿病足潰瘍(DFU)是糖尿病的并發癥之一，及時對DFU干擾醫治，可以有效降低肢體壞死和膿毒血癥的發生風險〔1〕。然而，DFU治療缺乏特效藥物，在DFU發生早期促進創面愈合仍是臨床上亟待解決的難題〔2〕。裸花紫珠在海南黎族區域較多，是海南傳統民族藥材，性味苦、微辛、平，具備散瘀、止血、解毒、消腫等功效。據研究，裸花紫珠的主要化學成分包括黃酮類化合物、揮發油、酚萜類等〔3〕，此外有研究顯示，裸花紫珠對創傷性傷口具有抗炎、止血和加速傷口愈合的作用〔4，5〕。有研究證明，胰島素樣生長因子(IGF)-1/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路影響DFU創面愈合具有重要的作用，本研究探討裸花紫珠調控IGF-1/PI3K/Akt信號通路對DFU大鼠創面愈合的影響。

1 資料與方法

1.1主要實驗儀器 超純水儀(上海訊輝環保科技有限公司公司)；激光共聚焦成像體系、切片機、展片機、烤片機(德國徠卡公司)；倒置光學顯微鏡(中國明美公司)；血糖儀及血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司)；Millpore-Q超純水器廣州東銳科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增儀(廣東精普實業有限公司)。

1.2主要實驗材料 裸花紫珠藥材購自海南省中醫院中藥房，檸檬酸鈉緩沖液、鏈脲佐菌素(STZ)均購自上海如吉生物科技有限公司，RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，PCR引物由云南一同實驗教育科技有限公司合成。引物序列(5′-3′)為：IGF-1上游：GTCGATTCGTAGCGGTTCGGA，下游：TCGATAGTCAAGGAAGTTA；IGF-1R上游：GGATTATCGGTAGGCCCAA，下游：TTGGCTTAGGTTCGAACC；PI3K上游：CGATGGCCTTAACGAGGTTAA，下游：TGGTTACAAGGTTCAC；Akt上游：ACGGCATGTTGGGCGTACCAGCT，下游：TTGGTTAATCCTCAAGG；eNOS上游：GAGACAGCCGGGCTTA，下游：TGATCGTAGTGATGATGATAA；VEGFR2上游：TCACGTGGTACTTAGGACC，下游：CAAGCTTACGA-TTCCGC。

1.3實驗動物 SPF級健康SD大鼠48只，雌雄各半，體重(200±22)g，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0011。

1.4方法

1.4.1裸花紫珠水提物制備 裸花紫珠干燥、粉碎、過40目篩，加水浸泡2 h后加熱回流提取3次，加水量為藥物質量10倍。在1 h后萃取1 h，在蒸發盤中取出過濾，并在水浴上蒸發后，在105℃下干燥24 h，干燥后快速冷卻半小時，得到提物。使用前用適量純凈水將藥物調勻。

1.4.2大鼠DFU模型制備及藥物干預方法 大鼠自適應喂養1 w，將12只大鼠隨機選擇正常組，剩余的大鼠用作模型組。正常組給予普通飼料喂養，模型組給予高糖高脂飼料(配料比例是雞蛋∶奶粉∶蔗糖∶豬油∶普通飼料為2∶5∶20∶15∶58)喂養4 w。

4 w后，禁食不禁水12 h，正常組一次性腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，模型組腹腔注1%STZ(45 mg/kg，由pH4.5的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液配制)創建糖尿病大鼠模型。注后3 d測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功〔2〕，若失敗則再次腹腔注射1%STZ溶液(10 mg/kg)，維持高血糖狀態4 w。此外，為避免大鼠死亡，若大鼠血糖高于25 mmol/L則給予胰島素降糖。

造模成功后取36只模型大鼠及正常組12只大鼠給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規消毒，使用直徑為2.5 cm的打孔機器，使傷口在大鼠背面，深度到筋膜層〔2〕。創面造模成功后，所有大鼠常規消毒止血。分為正常組、模型組、凡士林紗布組、裸花紫珠治療組各12只。正常組及模型組給予生理鹽水紗布外敷治療，其余兩組則用相應敷料紗布覆蓋創面治療。各組均在相應敷料上層再覆蓋無菌紗布并在最外層給予繃帶包扎，每日換藥1次。藥物干預期間密切觀察大鼠情況，如有撕咬敷料或紗布，及時處理。治療期間大鼠均單籠給予基礎飼料喂養，室溫維持在22～25℃，濕度55%～65%，保持12 h光照，晝夜循環。

1.4.3大鼠創面愈合情況及創面病理學觀察 分別于給藥后3、7 d觀察創面愈合情況，包括創面顏色、組織腫脹程度及滲出液等。操縱相機攝影，用Photoshop處理相片，測算創面面積，根據公式：創面愈合率=(創面初始面積-給藥后第n天創面面積)/創面初始面積×100%，計算創面愈合率。在上述觀察完成后，每組各隨機抽取6只大鼠，給予戊巴比妥鈉麻醉，采集創面及周圍2 mm的組織，一部分經過4%多聚甲醛固定組織24 h后，進行蘇木素-伊紅染色，觀察創面及創周組織學變化，包括毛細血管、炎癥細胞、纖維細胞等。另一部分生理鹽水沖洗后，吸干水分后置于-80℃冰箱，待RT-PCR檢測。

1.4.4大鼠創面組織中IGF-1、IGF-1受體(IGF-1R)、PI3K、Akt、一氧化氮合酶(eNOS)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)2 mRNA表達水平檢測 應用RT-PCR檢測組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表達水平。首先按照試劑(盒)說明書步驟提取組織總RNA并測定其含量，以cDNA為模板擴增。反應條件：95℃預備變性 10 min；95℃變性 10 s，56℃退火 30 s，72℃蔓延30 s，40個循環，2-ΔΔct法計算mRNA相對表達量。

1.4.5Western印跡檢測組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達 干預后取各組創面組織提取蛋白定量后保存。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉，隨后分別用IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2的一抗室溫孵育2～3 h，用相應的二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，最后超敏發光液顯色、曝光。

1.5統計學方法 采取SPSS25.0軟件單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況比較 開始喂食高脂高糖飼料至注射STZ溶液前，兩組毛色光滑明亮，飲食、活動均正常，第1周至第4周模型組體重較正常組明顯增長(P<0.05)，注射STZ溶液后，第5周兩組體重無明顯差異(P>0.05)，第6～8周模型組體重較正常組明顯下降(P<0.05)。見表1。注射STZ溶液后，模型組毛色逐漸枯黃、雜亂，皮下脂肪減少，并出現多飲、多食、多尿等現象，模型組與對照組注射后第3天血糖為〔(22.63±1.46)、(5.76±1.14)mmol/L〕，注射STZ前為〔(5.93±1.12)、(6.01±0.96)mmol/L〕，模型組注射STZ前后血糖存在顯著差異(P<0.05)，而正常組一般情況無明顯變化(P>0.05)。

2.2各組創面愈合率 治療后第3天和第7天，模型組的創面愈合率均明顯低于正常組，其中第3天凡士林紗布組、裸花紫珠組顯著高于模型組(P<0.05)。第7天凡士林紗布組較模型組愈合率明顯增高，而裸花紫珠組顯著高于凡士林紗布組及模型組(P<0.01)。見表2。

表1 兩組體重變化

表2 各組創面愈合率比較

2.3各組創面組織病理學對比 治療后第3天，正常組較多炎癥細胞浸潤，同時有少量毛細血管及纖維細胞生長；裸花紫珠組有較少炎癥細胞浸潤，有少量毛細血管及纖維細胞生長；凡士林紗布組有較多炎癥細胞浸潤，同時有少量纖維細胞及新生毛細血管；模型組有少量炎癥細胞浸潤和纖維細胞生長，并沒有顯著的新毛細血管。治療后第7天，正常組有較多炎癥細胞浸潤，纖維細胞生長活躍，毛細血管數量較前增加；裸花紫珠組可見大量炎癥細胞浸潤，纖維細胞和毛細血管生長活躍；凡士林紗布組有較多炎癥細胞浸潤，纖維細胞和新生毛細血管數量增加；模型組可見較多炎癥細胞，有少量纖維細胞和新生毛細血管。見圖1。

圖1 各組組織病理學(HE染色，×400)

2.4各組創面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達 干預后第3和7天，正常組、凡士林紗布組及裸花紫珠組創面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達均較模型組明顯升高，且正常組及裸花紫珠組明顯高于凡士林紗布組(P<0.05)。見表3、表4、圖2。

表3 各組創面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表達水平

表4 各組創面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達水平

1～4:正常組、模型組、凡士林紗布組、裸花紫珠組圖2 Western印跡檢測各組創面組織、IGF-1、 IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGF2蛋白

3 討 論

世界上大約有3.82億成年人患有糖尿病，約1.25%的足部糖尿病潰瘍可能導致截肢〔6〕。DFU常由外周腎病和外周血管疾病的缺血而發生，其治療主要包括清創及愈合過程〔7,8〕。DFU在中醫中屬于“脫疽”范疇。中醫認為，該病的關鍵病機在于氣血不足致新肉難生，故治療關鍵為“祛瘀生新”〔9〕。現代研究顯示，新生血管能為創面的愈合提供必要的血氧供應，促進創面組織生長，所以增加創面組織中新生毛細血管的數量是治療本病的關鍵〔2〕。裸花紫珠顆粒的主要成分為中藥裸花紫珠，系馬鞭草科植物裸花紫珠的葉內含縮合鞣酸、酚類等，能明顯抑制多種致病微生物，還能使毛細血管通透性降低、收縮血管，能明顯的抑制炎癥滲出及腫脹；據報道，一些化合物可以顯著縮短小鼠的出血、凝血時間，可以通過內源性凝血途徑〔10〕。本實驗病理結果提示，經裸花紫珠提取物外敷治療后，DFU模型大鼠創面組織血管生成旺盛。而根據RT-PCR研究結果，裸花紫珠促進血管生成的機制可能與IGF-1/PI3K/Akt信號通路有關。

VEGF是一種可通過提高活化因子和抑制因子-l的表達，提高血漿酶原活化因子的活性，促進蛋白水解，進而加速新生毛細血管的形成的高度特異性的促血管內皮細胞生長因子〔11〕。IGF-1是一種在分子結構上與胰島素近似的多肽蛋白。可通過誘導相關細胞因子的表達，推動創面組織修復〔12〕。研究顯示，IGF-1在糖尿病患者體內濃度低下，是DFU創面難以愈合的重要原因〔13〕。 創面愈合的過程除了需要各種細胞和細胞因子進行參與之外，還有必要通過復雜的信號通路調節細胞內各種基因的表達，PI3K/Akt 信號通路是與細胞生長密切相關的信號途徑，該信號通路在調節細胞生長、增殖、凋亡方面具有重要作用〔14〕。研究表明，糖尿病皮膚潰瘍的發生與 IGF-1 密切相關，IGF-1 能促進成纖維細胞增殖和分化，有效增加胞外基質如膠原、聚葡萄糖胺、纖粘連蛋白等合成及分泌。機體長期處于高糖狀態使 IGF-1 的表達減少，影響潰瘍修復。而因 IGF-1R 對 IGF-1 的高親和力，可通過檢測 IGF-1R 來提示 IGF-1 的表達情況〔15〕。據研究顯示，IGF-1能特異性結合IGF-1R激活PI3K/Akt信號通路〔16〕，進而磷酸化多種激活因子如eNOS〔17〕，參與血管生成的各個環節。同時磷酸化的Akt能提高VEGF主要功能受體VEGFR2的表達，增強VEGF的生物學活性〔18〕。本研究結果提示，裸花紫珠可能通過調控IGF-1/PI3K/Akt信號通路，增加組織中VEGFR2釋放，達到促進血管生成的目的。

綜上，裸花紫珠對于DFU具有良好的治療作用，大多是通過調節IGF-1/PI3K/Akt信號通路來上調組織中的基因表達水平，促進成纖維細胞和新生兒毛細血管增殖，改善傷口的血液循環，使上皮細胞加速生長，最終有效促進傷口組織修復，可作為DFU外用配方進行深入研究。