腎上腺素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移的影響及其相關(guān)機(jī)制

于桂發(fā) 張璞微 吳春霞 樊晨星 李昆

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

乳腺癌已經(jīng)成為現(xiàn)代女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首〔1,2〕。三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種特殊亞型，其特征是雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體均為陰性〔3,4〕。與其他亞型的乳腺癌相比，三陰性乳腺癌具有惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等特點(diǎn)〔5〕。三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，除了臨床治療方面的影響外，患者本身的個(gè)體因素也可能會(huì)影響乳腺癌的進(jìn)程〔6〕。大多數(shù)三陰性乳腺癌患者在臨床治療過(guò)程中情緒上會(huì)產(chǎn)生較大波動(dòng)，一般體現(xiàn)為焦慮、恐懼、抑郁等不良情緒反應(yīng)〔7〕。長(zhǎng)期處于這種不良情緒中會(huì)導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能失調(diào)，腎上腺素等應(yīng)激激素分泌增多〔8,9〕。但異常分泌的腎上腺素是否對(duì)三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的影響卻鮮有研究。本研究旨在探討腎上腺素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-10A、MDA-MB-231細(xì)胞均購(gòu)自南京凱基生物有限公司。L15不完全培養(yǎng)基購(gòu)自南京凱基生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Serana公司；青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶消化液均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、GAPDH均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、P-ERK1/2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；C-MYC、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司；Anti-ADRB2抗體購(gòu)自Affinity Biosciences公司；腎上腺素粉末購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%青鏈霉素的L15不完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTS法檢測(cè)腎上腺素對(duì)MDA-MB-231增殖能力的影響 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，按照8×103個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)量將細(xì)胞鋪入96孔板中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。吸出舊液，加入配制好的各濃度腎上腺素溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，同時(shí)設(shè)置空白組、對(duì)照組；繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、72 h時(shí)采用細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(MTS)法檢測(cè)各分組吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎上腺素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 選用0.010、0.100、0.100、1.000、10.000 μmol/L 5種濃度作為代表評(píng)估腎上腺素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，按照8×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)量將細(xì)胞鋪入6孔板中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。待長(zhǎng)成單層后，用200 μl槍頭在每個(gè)孔中間劃“+”字，將舊液吸出，用PBS將脫落的細(xì)胞洗凈，每孔加入3 ml無(wú)血清的L15不完全培養(yǎng)基，用封口膜將蓋板封好，使用普光顯微鏡進(jìn)行加藥前拍照。吸出培養(yǎng)液，依次加入用無(wú)血清L15不完全培養(yǎng)基配制好的各濃度腎上腺素，對(duì)照組不加藥，加藥后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在加藥后12、24、36、48 h進(jìn)行拍照，拍照方式同前，每次拍照時(shí)盡量與上次拍照位置保持一致。

1.2.4Western印跡檢測(cè)人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與MDA-MB-231細(xì)胞表面β2腎上腺素受體(ADRB2)表達(dá)情況 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞消化后制成懸液，分別收樣于EP管中，5 500 r/min離心5 min后每管加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液100 μl,渦旋混勻后靜置于冰上使其充分裂解后提取總蛋白。對(duì)各組提取的蛋白進(jìn)行定量后，分別吸取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，BSA封閉,加入一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗膜，加入二抗,室溫下孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL進(jìn)行顯色，使用自動(dòng)電泳凝膠成像儀采集圖像，分析條帶灰度值。

1.3Western印跡檢測(cè)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游相關(guān)蛋白C-MYC、MMP2、MMP9表達(dá)情況 選用0.1 μmol/L的腎上腺素作為代表來(lái)評(píng)估腎上腺素對(duì)靶蛋白表達(dá)情況的影響。將加藥處理后的MDA-MB-231細(xì)胞消化后收樣于EP管中，另設(shè)不加藥物的對(duì)照組，離心后每管加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液100 μl,渦旋混勻后靜置于冰上使其充分裂解提取總蛋白。定量后，分別吸取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，BSA封閉,加入一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗膜，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL進(jìn)行顯色，使用自動(dòng)電泳凝膠成像儀采集圖像，分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與MDA-MB-231細(xì)胞表面ADRB2表達(dá)情況 與人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞(0.091±0.018)相比，MDA-MB-231細(xì)胞表面ADRB2表達(dá)水平(0.133±0.015)明顯升高(P=0.028 7)。見(jiàn)圖1。

圖1 人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與人乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞表面ADRB2

2.2腎上腺素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 腎上腺素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 濃度為0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、20.000、40.000、60.000、80.000 μmol/L的腎上腺素在分別作用36 h后，其增殖率分別為(119.30±7.25)%、(115.01±2.52)%、(119.08±5.04)%、(113.80±1.79)%、(110.19±1.10)%、(108.41±1.08)%、(108.36±0.49)%、(108.29±2.37)%、(108.33±2.38)%，與對(duì)照組(100.00±0.00)%相比，上述濃度的腎上腺素都能明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖(P<0.01)，但腎上腺素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的這種促增殖作用并未呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性；濃度為0.100 μmol/L的腎上腺素在分別作用12、24、36、48、72 h后，其增殖率分別為(120.38±17.66)%、(120.29±3.07)%、(119.08±5.04)%、(113.66±4.83)%、(110.60±7.94)%，腎上腺素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的這種促增殖作用并未呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。濃度為100.000、500.000、1 000.000、5 000.000 μmol/L的腎上腺素在分別作用36 h后，其增殖率分別為(96.55±1.61)%、(90.61±0.78)%、(63.17±5.37)%、(37.59±4.33)%，與對(duì)照組相比，上述濃度的腎上腺素都能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖(P<0.01)，且這種增殖抑制作用具有濃度依賴性。

2.3腎上腺素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 腎上腺素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 濃度為0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L的腎上腺素在分別作用36 h后，其遷移率分別為〔(82.83±4.71)%、(74.05±3.83)%、(77.07±6.09)%、(79.31±2.80)%、(81.35±1.21)%〕，與對(duì)照組的遷移率〔(60.64±1.12)%〕相比，上述濃度的腎上腺素都能明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移(P<0.01)，但并未發(fā)現(xiàn)腎上腺素的這種促遷移作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性；濃度為0.100 μmol/L的腎上腺素在分別作用12、24、36、48 h后，其遷移率與對(duì)照組遷移率的比值分別為1.28±0.02、1.28±0.03、1.22±0.01、1.19±0.02，腎上腺素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的這種促遷移作用并未呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同濃度腎上腺素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響(×100)

圖3 腎上腺素作用不同時(shí)間對(duì)人乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響(×100)

2.4ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，腎上腺素組總ERK1/2表達(dá)量無(wú)明顯變化，但腎上腺素可以明顯上調(diào)P-ERK1/2的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

表1 腎上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中ERK1/2及P-ERK1/2表達(dá)

圖4 腎上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中ERK1/2及P-ERK1/2表達(dá)

2.5ERK信號(hào)通路下游C-MYC、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，腎上腺素可以明顯地上調(diào)C-MYC、MMP-2、MMP-9表達(dá)(P<0.01，P<0.001)。見(jiàn)圖5、表2。

圖5 腎上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中 C-MYC、MMP-2、MMP-9表達(dá)

表2 腎上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中 C-MYC、MMP-2、MMP-9表達(dá)情況

3 討 論

研究顯示，一定濃度范圍內(nèi)的腎上腺素能夠促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖與遷移。腎上腺素可以與腎上腺素受體結(jié)合，改變細(xì)胞內(nèi)第二信使水平，啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)器上產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)〔10,11〕。腎上腺素受體作為G蛋白耦聯(lián)受體家族中的成員之一，具有多種亞型。腎上腺素受體分為α受體和β受體，而在不同細(xì)胞株表面這兩種受體的亞型的表達(dá)強(qiáng)度又不盡相同〔12～14〕。以往的研究顯示，MDA-MB-231細(xì)胞表面存在著大量的ADRB2〔15,16〕。本研究結(jié)果推測(cè)，腎上腺素可能與MDA-MB-231細(xì)胞表面表達(dá)的ADRB2結(jié)合，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的信號(hào)通路，最終促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖與遷移。

ERK信號(hào)通路是一種經(jīng)典的調(diào)控細(xì)胞增殖與遷移的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，腎上腺素可以與細(xì)胞膜表面的ADRB2結(jié)合，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活ERK信號(hào)通路，使ERK1/2磷酸化水平升高，并對(duì)其下游與細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)的蛋白進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移〔17〕。因此，推測(cè)腎上腺素促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖與遷移是在細(xì)胞表面的ADRB2的介導(dǎo)下通過(guò)激活ERK信號(hào)通路，最終促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖與遷移。

綜上，腎上腺素可以在MDA-MB-231細(xì)胞表面ADBR2的介導(dǎo)下通過(guò)調(diào)控ERK信號(hào)通路及其下游相關(guān)蛋白c-myc、MMP-2、MMP-9來(lái)促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖與遷移。長(zhǎng)期處于不良情緒狀態(tài)下的三陰性乳腺癌患者體內(nèi)腎上腺素分泌異常〔18,19〕，因此，臨床上在對(duì)待三陰性乳腺癌患者時(shí)，要注意觀察這類患者的情緒變化，及時(shí)進(jìn)行心理干預(yù)，盡可能減少腎上腺素的異常分泌，從而對(duì)臨床乳腺癌的治療起到一定輔助作用。