橄欖苦苷對大鼠脊髓損傷模型神經功能恢復的治療作用

向梅 張挺

(武漢市武昌醫院 武漢科技大學附屬武昌醫院，湖北 武漢 430063)

脊髓損傷(SCI)是一種導致永久性殘疾的嚴重創傷。其病理過程分為兩個階段：原發性損傷是由脊髓組織直接破壞引起的；繼發性損傷包括軸突破壞、神經元死亡、炎癥、血腦屏障破壞、缺氧和缺血〔1,2〕。繼發性損傷期間的這些事件導致神經元死亡和功能障礙，導致SCI后有限的功能恢復〔3〕。因此，目前對于中樞神經系統(CNS)損傷的治療主要側重于通過減少神經元死亡和修復功能性神經進而預防或減少繼發性SCI〔4，5〕。

橄欖苦苷(OE) 屬于環烯醚類葡萄糖苷，廣泛存在于木犀科植物中，在油橄欖葉中含量尤為豐富，具有器官保護、降血脂、降血壓、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理作用〔6～9〕。近年來OE對神經損傷的保護作用逐漸引起了人們的關注。研究說明OE在人膠質母細胞瘤細胞中具有有效的抗氧化特性，可以對神經元發揮其保護作用〔10〕；另外其對大鼠神經元損傷具有保護作用，該作用與抑制炎性反應有關〔11〕。本研究旨在闡明OE是否可通過抑制免疫炎癥反應進而發揮對SCI大鼠神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 OE購自隴南田園油橄欖科技開發有限公司(純度>98%)，成年雌性SD大鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司(中國，220～250 g，n=45)隨機分為3組，假手術(Sham)組、SCI組和SCI+OE組，水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉，SCI組和SCI+OE組行T9椎板切除術，用血管夾(Oscar，中國)造成中度擠壓傷，30 g力作用1 min，Sham組僅行T9椎板切除術。術后護理包括每日兩次膀胱排空和腹腔注射頭孢唑啉鈉(50 mg/kg)。術后SCI+OE組每天灌胃給予OE(50 mg/kg)〔12〕。Sham組和SCI組給予等量生理鹽水。

1.2行為分析 對各組大鼠術后7、14、21和28 d進行脊髓損傷(BBB)評分、斜面測試實驗及足跡試驗，并對收集到的足跡進行分析和評估。

1.3組織學染色 在SCI后第28天，大鼠麻醉并經心臟灌注0.9%氯化鈉，然后用4%多聚甲醛(PFA)固定。收集包含病變部位的T7～T9脊髓段，在4%PFA中固定48 h，然后石蠟包埋進行石蠟切片。取厚5 μm的橫切面按廠家說明書對進行蘇木素-伊紅(HE)染色和尼氏(Nissl)染色。圖像均采用光學顯微鏡(日本東京奧林巴斯)獲得。HE染色后切片病理評分標準:0分=無損壞;1分=灰質中有1～5個嗜酸性神經元;2分=灰質中有6～10個嗜酸性神經元;3分=灰質中有10個以上嗜酸性神經元;4分=腦灰質梗死面積占1/3以內;5分=腦灰質梗死面積占1/3～1/2；6分=腦灰質梗死面積占1/2以上。Nissl染色計數每次觀察3個視野。

1.4免疫熒光染色 傷后3 d取脊髓組織標本，收集包含病變部位的T7～T9脊髓段。所有脊髓用4%PFA固定，沖洗，石蠟包埋。切割厚度為5 μm的橫切面，在二甲苯中脫蠟，并用乙醇洗滌重新水化。切片在室溫下與10%正常山羊血清在含0.1%tritonx-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)中孵育1 h。然后將它們與適當的一級抗體在同一緩沖液中于4℃孵育過夜。一級抗體孵育后，將切片洗滌4×10 min，然后在室溫下與Alexa Fluor 488/594山羊抗兔/鼠二級抗體孵育1 h。切片用PBS沖洗3次，并與4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育10 min，最后在PBS中洗滌并用蓋玻片密封。熒光顯微鏡(日本東京奧林巴斯公司)對圖像進行拍攝，對每只動物病變部位30～40個隨機切片的進行計數。每組重復3次。

1.5Western印跡 傷后3 d，使用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液(Beyotime，中國上海)從脊髓提取總蛋白(收集包含病變部位的T7～T9脊髓段)，然后使用增強的BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime，中國上海)使用微孔板讀取器(分子器件Flexstation 3，美國)測量蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 ng組織蛋白并轉移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，California，USA)。用5%脫脂乳封閉2 h后，用抗酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3(1∶500)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(1∶200)、白細胞介素(IL)-1β(1∶500)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶5 000)孵育細胞膜。然后，用3次TBS洗滌膜5 min，并用辣根過氧化物酶結合的二級抗體處理。用TBST洗滌3次后，用電化學發光加試劑(Invitrogen，Carlsbad，USA)觀察印跡。每組重復3次。

1.6統計學方法 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1OE可促進SCI后的運動功能恢復 SCI組和SCI+OE組0、7、14、21、28 d BBB評分、斜面試驗顯著低于Sham組(P<0.05)。SCI+OE組14、21、28 d BBB評分、斜面試驗顯著高于SCI組(P<0.05)。見表1、2。與Sham組清晰足跡相比，SCI組后肢出現明顯的拖拽(紅色足跡)，而SCI+OE組顯示出相當一致的后肢軌跡，幾乎沒有絆倒(圖1)，其運動功能得到了明顯的改善。

表1 各組不同時間BBB評分比較分)

表2 各組不同時間斜面試驗比較

圖1 各組運動功能

2.2OE可明顯改善SCI引起的形態學改變 HE染色顯示，SCI組神經元腫脹較對照相比明顯加重；而SCI+OE組與SCI組相比其神經元腫脹程度明顯減輕。Nissl染色顯示，SCI組Nissl小體在胞質內聚集，與Sham組相比染色較深，而SCI+OE組染色明顯較SCI組變淺。BBB評分及Nissl染色計數均顯示SCI+OE組較SCI組脊髓損傷引起的形態學改變得到明顯改善(P<0.01)。見圖2、表3。

圖2 OE可改善SCI引起的形態學改變

表3 BBB評分及Nissl染色細胞數

2.3OE可降低SCI引起的神經元炎癥反應 與Sham組比較，星形膠質細胞激活的標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及小膠質細胞激活的標志物(Iba1)在SCI組中呈現明顯高表達(P<0.001)；而SCI+OE組與SCI組相比以上兩種標志物均明顯減少(P<0.01)。見圖3、表4。

圖3 3組脊髓切片免疫熒光染色(×200)

表4 3組脊髓中GFAP及Iba1表達水平

2.4OE可通過抑制免疫炎癥反應進而減輕神經元細胞過度凋亡 SCI組與Sham組相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β(P<0.05)明顯增加。SCI+OE組與SCI組相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α及IL-1β明顯下降(P<0.01)。見圖4、圖5、表5。

圖4 OE可通過抑制免疫炎癥反應進而減輕神經元細胞過度凋亡(免疫熒光染色，×200)

圖5 各組Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β蛋白表達

表5 3組神經元細胞中Cleaved-caspase-3、 TNF-α及IL-1β蛋白表達

3 討 論

SCI是一種嚴重的中樞神經系統疾病，據統計美國每年有 8 000～11 000例新發SCI患者〔13〕，其發病與炎癥反應息息相關。

OE一種無毒的多酚類裂環烯醚萜苷類化合物〔14，15〕，其具有多種藥理作用，已被廣泛應用于臨床各類疾病的治療及預防中。在神經保護方面，其作用同樣較為顯著，Pantano等〔16〕的研究說明在 小鼠中添加OE和多酚類化合物可顯著改善高脂血癥小鼠的認知功能，表明OE對行為表現和神經病理學有一定的影響，可以產生類神經保護作用。另外OE具有不同程度的抗炎活性。一項動物實驗研究表明OE可以通過抑制Toll樣受體(TLR)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號傳導來減少炎癥反應，并且可以用作抗炎藥進行臨床應用〔17〕；Horcajada等〔18〕的研究證明OE可明顯減慢豚鼠自發性骨關節炎病變的進程，減少其免疫炎癥反應，對骨關節具有重要的保護作用。

據報道，運動功能學測定在SCI的評估中具有明確的有效性和可靠性〔19〕。本研究結果發現OE可在一定程度上促進SCI大鼠運動功能的恢復；OE可改善大鼠神經元腫脹程度。

有研究表明膠質細胞的狀態對SCI后運動功能的評估具有重要的意義和價值，其過度激活表明炎癥反應的增強〔20〕。本研究結果說明SCI可引起神經元炎癥反應，OE可改善SCI引起的神經元炎癥過度激活狀態；SCI可致神經元細胞凋亡增加，而OE可降低該凋亡現象，因此認為OE可通過抑制免疫炎癥反應進而減輕神經元細胞過度凋亡，從而發揮其對SCI的保護作用，但其具體作用機制仍需進一步研究加以證實。