基于線粒體凋亡通路探究右美托咪定對心肌缺血再灌注模型大鼠的干預(yù)效果

王麗 王少微 賈彤 孫曉佳 邢珍 劉輝 姚杰 陳艷林

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科，河北 張家口 075000)

心肌缺血是一種病理生理狀態(tài)，是由于心臟的血液灌注量減少，從而導(dǎo)致心臟供氧不足，心肌能量代謝異常的現(xiàn)象〔1,2〕。有研究表示，冠心病、變異性心絞痛、心肌橋等是主要病因〔3〕。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中老年人為易發(fā)人群，男性發(fā)病人數(shù)高于女性，發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，近年來該病發(fā)病率呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著患者的健康〔4,5〕。右美托咪定是一種注射劑，具有鎮(zhèn)定安神的作用〔6〕。本研究建立心肌缺血再灌注大鼠模型，分析右美托咪定對心肌缺血再灌注模型大鼠線粒體凋亡通路的影響，旨在探討右美托咪定是否經(jīng)線粒體凋亡通路參與該病的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SPF級雄性大鼠(山東軒竹醫(yī)藥科技有限公司，使用許可證號：SYXK(魯)20200001)，2～4月齡，平均(3.1±0.8)月齡；體重265～312 g，平均體重(288.5±18.8)g。在相對濕度40%～65%、溫度(24.1±2.6)℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。本試驗(yàn)嚴(yán)格按照動物實(shí)驗(yàn)倫理要求進(jìn)行操作，且通過醫(yī)院倫理委員會審批同意。主要試劑：小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)抗體(BD公司)、小鼠抗兔C反應(yīng)蛋白(CRP)抗體(Dako公司)、兔抗小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Gibco公司)、大鼠抗兔丙二醛(MDA)抗體(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、大鼠抗小鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗體(Sigma公司)、兔抗大鼠細(xì)胞色素(Cyto)C、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(Hyclone公司)。主要儀器：多道生理記錄儀(河南華南醫(yī)電科技有限公司)、光學(xué)顯微鏡(上海炳宇光學(xué)儀器有限公司)、流式細(xì)胞儀(天津眾立生物科技有限公司)、小動物呼吸機(jī)(天津儀數(shù)科技有限公司)、彩色多普勒超聲診斷儀(徐州貝爾斯電子科技有限公司)、PE50動脈導(dǎo)管(上海瑾瑜科學(xué)儀器有限公司)。

1.2分組及建模 隨機(jī)選取10只大鼠作為正常組，剩余30只大鼠參照羅敏等〔7〕研究建立心肌缺血再灌注模型，30只雄性大鼠分別禁食12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位進(jìn)行固定，小動物呼吸機(jī)機(jī)械通氣，四肢皮下插入電極，連接心電圖。在大鼠胸骨左緣第4肋間逐層打開胸腔，充分暴露心臟和血管，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，誘發(fā)心肌缺血30 min，然后松開結(jié)扎線再灌注60 min。心肌缺血再灌注造模成功的標(biāo)志，心電圖ST段明顯抬高、T波高聳。建模過程中大鼠死亡2只，將剩余的28只大鼠，隨機(jī)分為再灌注組、右美托咪定組各14只，在灌注組建模前2 h靜脈注射氯化鈉溶液，右美托咪定組建模前2 h靜脈注射右美托咪定，正常組未做處理。

1.3樣本采集 各組大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm，分離血清-40℃保存。處死大鼠取其心臟組織，將大鼠心臟組織置于丙酮-干冰飽和溶液中，石蠟包埋保存，以便后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.4多道生理記錄儀檢測心臟血流動力學(xué)水平 將大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后，分離右頸總動脈，將PE50動脈導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈插入左心室，固定后用多道生理記錄儀，檢測并記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt)水平。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色和梗死面積檢測 取出包埋后標(biāo)本，垂直連續(xù)切片，將標(biāo)本脫蠟處理，用蘇木素浸泡、染色，2%鹽酸酒精分化，使用自來水充分清洗，1%濃度伊紅染色，酒精浸泡、脫水，中性樹膠封片，放置顯微鏡下觀察。染色完畢后，用多聚甲醛固定，稱重，ImageJ圖像分析軟件計(jì)算大鼠的心肌梗死面積。

1.6酶標(biāo)分析儀檢測炎癥因子水平 將待測血清按比例稀釋，酶標(biāo)板添加100 μl待測血清、標(biāo)準(zhǔn)液，震蕩均勻，恒溫箱靜置60 min，每孔加洗滌液浸泡2 min，甩干，反復(fù)洗板3次，每孔加40 μl蒸餾水、一抗，混合均勻，恒溫靜置30 min，重復(fù)洗滌步驟，每孔加酶標(biāo)抗體60 μl，37℃靜置15 min，每孔加底物液60 μl，避光靜置10 min，每孔加終止液60 μl。在酶標(biāo)板450 nm處測吸光值，計(jì)算IL-6、CRP、TNF-α水平。

1.7流式細(xì)胞儀檢測氧化應(yīng)激因子水平 取兩個標(biāo)記為待測管、對照管的試管備用，對照管和待測管分別加100 μl標(biāo)準(zhǔn)液、待測血清和40 μl蒸餾水、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝液，兩管均加有熒光標(biāo)記物的單克隆抗體，待測管再加有熒光標(biāo)記物的免疫球蛋白20 μl，恒溫放置30 min，兩管均加溶血劑靜置15 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，反復(fù)洗滌2次，添加磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μl懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測MDA、GSH-Px、SOD水平。

1.8Western印跡法檢測CytoC、Caspase-3通路蛋白相對表達(dá)量 待測血清用細(xì)胞裂解液裂解，測定待測血清中的蛋白濃度，加入適量的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，沸水水浴加熱5 min，以充分蛋白變性，使用NC膜轉(zhuǎn)模，Western洗滌液漂洗2 min，加Western封閉液，恒溫靜置60 min，加Western一抗稀釋液，恒溫孵育60 min，回收一抗，加洗滌液漂洗5 min，反復(fù)洗滌3次，加入Western二抗稀釋液由辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，恒溫孵育60 min，回收二抗，充分洗滌后顯色、成像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0進(jìn)行重讀測量方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心房肌組織病理學(xué)觀察 正常組心肌組織結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，肌原纖維分布規(guī)則；再灌注組心肌組織排列稀疏、雜亂，細(xì)胞內(nèi)有明顯水腫，肌原纖維有斷裂現(xiàn)象；右美托咪定組心肌組織排列較緊密，細(xì)胞內(nèi)水腫減輕，肌原纖維斷裂現(xiàn)象明顯改善。見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色觀察(×200)

2.2各組心臟血流動力學(xué)水平和梗死面積比較 如表1所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較低，LVEDP水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較高，LVEDP水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與再灌注組比較，右美托咪定組梗死面積較小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3各組炎癥因子水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組氧化應(yīng)激因水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組MDA水平較高，GSH-Px、SOD水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組MDA水平較低，GSH-Px、SOD水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組心臟血流動力學(xué)水平和梗死面積比較

表2 各組炎癥因子、氧化應(yīng)激水平比較

2.5各組線粒體凋亡通路蛋白相對表達(dá)量對比 如表3、圖2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組各蛋白表達(dá)量較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組各蛋白表達(dá)量較低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組線粒體凋亡通路蛋白相對表達(dá)量對比

1～3：正常組、再灌注組、右美托咪定組圖2 各組線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)

3 討 論

心肌缺血是由于冠狀動脈狹窄、痙攣、栓塞等引起的心肌供血、供氧不足，主要分為心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死四個類型〔8〕。心肌缺血確診后需長期治療，患者主要表現(xiàn)為心悸、頭暈、胸悶等常伴隨全身乏力、水腫、發(fā)熱甚至引發(fā)休克，嚴(yán)重威脅患者的生命〔9,10〕。臨床常用藥物對患者治療，但由于心肌缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無特效藥，因此尋找安全有效藥物是治療心肌缺血的關(guān)鍵〔11〕。

梗死面積是判定心肌缺血再灌注損傷的公認(rèn)指標(biāo)，心肌梗死是心肌組織的不可逆損傷，故心肌缺血再灌注大鼠模型梗死面積越大，表明其心肌組織的損傷度越高〔12,13〕。本文研究表明，使用右美托咪定處理大鼠，能有效減少大鼠梗死面積，提升心肌缺血再灌注大鼠的心肌保護(hù)力。

右美托咪定是一種具有強(qiáng)效、高選擇性的α2腎上腺素受體激動藥物，有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動力學(xué)、呼吸抑制較輕的特點(diǎn)〔14〕。有學(xué)者研究表示，右美托咪定+咪達(dá)唑侖聯(lián)合用藥有助于緩解體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而有效減輕心肌組織的損傷〔15〕。右美托咪定可通過調(diào)控IL-6、IL-3、LVSP、LVEDP水平，減輕心肌缺血再灌注過程中炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體血流動力學(xué)水平，從而起到保護(hù)心肌組織的作用〔7〕。分析其原因可能是由于炎癥反應(yīng)可參與心肌損傷的過程相關(guān)，當(dāng)炎癥因子水平被抑制后，其心肌組織的損傷可明顯減輕，心室功能得到明顯改善；心臟血流動力學(xué)水平的提升，可使心臟供血、供氧能力提升，從而弱化其損傷的過程〔16〕。本文研究表明，經(jīng)右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠血流動力學(xué)水平提升、炎癥因子水平下降，從而使心肌組織損傷明顯降低，進(jìn)而抑制心肌組織進(jìn)一步損傷，促進(jìn)其相關(guān)功能的修復(fù)。

線粒體是調(diào)節(jié)大部分凋亡通路的細(xì)胞器，可通過多種應(yīng)力刺激激活，導(dǎo)致線粒體外膜的改變〔17〕。CytoC由CYCS基因編碼，是一種高度保守的蛋白質(zhì)，從線粒體泄露出CytoC可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Caspase-3屬于Caspase家族，是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，與眾多底物作用，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞發(fā)生特有改變〔18,19〕。目前已有研究顯示，促凋亡蛋白CytoC的增加和釋放可激活Caspase-3的活性，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致心臟功能損傷〔20〕。本研究結(jié)果表明右美托咪定可能經(jīng)促進(jìn)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白失活，有效阻止心肌細(xì)胞的程序性死亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

雖然本文結(jié)果顯示，右美托咪定可能通過促進(jìn)線粒體凋亡通路失活，抑制心肌組織損傷，但目前臨床研究并沒有顯示右美托咪定、促進(jìn)線粒體凋亡通路與心肌缺血再灌注的關(guān)系，且本研究例數(shù)較少，存在一定的局限性，因此該結(jié)果仍需進(jìn)一步證實(shí)，以期為臨床心肌缺血再灌注的診治提供新的思路。

綜上所述，使用右美托咪定對心肌缺血再灌注大鼠進(jìn)行治療，能有效改善心臟血流動力學(xué)水平，緩解炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體抗氧化能力，減少梗死面積，其作用機(jī)制可能促使線粒體凋亡通路信號通路失活。