雷米普利與骨髓間充質干細胞對Ⅳ型心腎綜合征的治療效果

馬逸群 邵麗詩 張婭 夏春娟 時琛 王家平 宋超 王世平 萬珊杉

(1漢中市三二○一醫院影像科，陜西 漢中 723000；2昆明醫科大學第二附屬醫院影像科；3云南昆鋼醫院放射科)

心臟和腎臟疾病可通過不同的機制相互影響，在病理狀態下其中一個臟器的損傷會導致另一個臟器的急性或慢性損傷，即心腎綜合征(CRS)〔1,2〕。Bagshaw等〔3〕將之分為5種亞型，其中Ⅳ型(慢性CRS)是指在長期慢性腎臟疾病的基礎上出現的慢性心臟損傷。CRS在全球的發病率日益提高，目前臨床針對CRS主要的治療方式為藥物保守治療，尚缺乏特異的治療方法〔4〕。隨著再生醫學的發展，干細胞研究對慢性腎臟病(CKD)的治療提供了新的思路，已有的研究表明骨髓間充質干細胞(BMSCs)可對慢性腎臟病起到有效的治療效果，同時對CRS起到較好的改善效果〔5〕。實驗表明經腎動脈移植干細胞的歸巢效果優于外周靜脈，本實驗采用經腎動脈移植BMSCs與雷米普利灌胃對CRS大鼠的治療效果比較，探索CRS更為有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器 雄性清潔級SD大鼠42只，由昆明醫科大學提供。培養基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%乙二胺四乙酸(EDTA，美國Gibco公司)；雷米普利(北京賽諾菲制藥有限公司)；離心管、細胞培養瓶(無錫NEST公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)。

1.2實驗方法

1.2.1BMSCs的培養 選擇2只6周齡雄性SD大鼠〔體重(120±10)g〕提取BMSCs。脫頸處死，于75%乙醇中浸泡10 min，取雙側股骨置于含有PBS的培養皿中并剪斷干骺端，用DMEM培養基反復沖洗骨髓腔至沖洗液變透亮；收集大鼠的細胞懸液于15 ml離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，用PBS吹打重懸后再以1 000 r/min離心8 min后棄上清液，以10%FBS與1%青鏈霉素的完全培養液重懸細胞；將細胞懸液接種在塑料培養瓶中并置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中孵育。24 h后首次換液，此后每3 d換液1次。1 w后于倒置顯微鏡下觀察BMSCs生長融合至80%～90%時按照1∶3傳代。取P4-P6 BMSCs備用。

1.2.2模型的制作與分組 將32只10周齡大鼠〔體重(200±15)g〕建立慢性腎臟病模型。用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，按照文獻所述方法〔6〕建立左側輸尿管梗阻慢性腎臟病模型，此后第8周收集尾靜脈血及尿液檢測腎功能，以血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白升高表示慢性腎臟病模型構建成功。然后隨機分為雷米普利治療組(A組)，BMSCs移植組(B組)，雷米普利與BMSCs聯合治療組(C組)，Ⅳ型CRS對照組(CRS組)各8只；剩余8只健康鼠為生理鹽水對照組(N組)。

1.2.3各組的治療方法 制備雷米普利溶液，A組8只大鼠按照5.0 mg/(kg·d)劑量灌胃。取傳代至P4-P6、生長至80%～90%融合的BMSCs，用L-DMEM培養基將BMSCs制成細胞懸液后(3×106/ml)分別收集于16支1.5 ml EP管中,每支0.5 ml，于-4℃保存。B組大鼠麻醉后仰臥位固定，備皮、消毒后，用超聲探頭沿腹主動脈找到左腎動脈分叉處，在超聲引導下以胰島素針吸取配好的BMSCs分別經皮穿刺至左腎動脈分叉處，確定無外漏后注射BMSCs 0.5 ml，術后將大鼠送回飼養籠中單只飼養；C組在雷米普利灌胃后立即采用上述方法給與腎動脈移植BMSCs；CRS組和N組在每次操作的同時采用等量的生理鹽水灌胃。

1.2.4生化指標的收集與檢測 各組在治療后第1周末將大鼠置于單只代謝籠內，收集24 h尿液并行尾靜脈采血，用全自動生化儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)與24 h尿蛋白。

1.2.5心臟與腎臟的病理檢測 脫頸處死大鼠后取心臟和腎臟，用10%的甲醛固定后石蠟包埋，行HE染色和Masson染色，觀察心臟及腎臟組織的病理結構改變。每組Masson染色結果隨機選擇10個視野，采用Image Pro6.0計算心肌組織中膠原容積分數(CVF)。

1.2.6心、腎細胞TUNNEL檢測 用石蠟包埋的各組大鼠心、腎組織并切片，按照試劑盒說明嚴格操作進行細胞凋亡檢測，凋亡細胞核呈棕黃色，記為陽性。

1.2.7透射電鏡檢測 取新鮮腎臟與心臟組織，體積約為1 mm×1 mm×1 mm，迅速放入TEM固定液中常溫固定2 h，0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次15 min，再以1%鋨酸·0.1 mol/L磷酸緩沖液室溫固定2 h，使用丙酮梯度脫水后用滲透過夜并包埋，將樣本插入包埋板并置于37℃烤箱過夜，再以60℃烤箱聚合48 h，采用切片機將樣本切為60～80 nm切片，并用鈾鉛雙染色，室溫過夜后置于TEM下觀察。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、LSD-t法、秩和檢驗。

2 結 果

2.1一般狀況 各組大鼠在注射ADR后1 w左右均出現不同程度的腹瀉伴食欲下降，第5周開始逐漸出現不同程度的腹水及水腫表現。建模過程中B組1只大鼠死亡、C組2只大鼠死亡，剔除后重新建模并補充實驗數據。

2.2超聲引導下移植BMSCs 于超聲引導下沿大鼠腹主動脈下行，找到左側腎動脈分叉處，用胰島素針吸取BMSCs，在超聲引導下經皮穿刺，針頭至左腎動脈分叉處注射BMSCs。見圖1。

2.3血、尿生化檢測結果 A、B、C、CRS組經治療后腎功能均有所改善，在治療后第1周末B組與C組BUN、Scr、24 h尿白蛋白總量均明顯低于CRS組(P<0.05)，其中C組各檢測指標相對A組下降更為明顯(P<0.01)，而相對于B組雖有下降但無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 超聲引導下穿刺結果(箭頭所示為針頭位置)

表1 各組治療后第1周末血、尿生化指標結果

2.4腎臟與心臟的病理檢查結果 N組腎固有細胞、腎間質未見明顯異常；心肌細胞形態結構完整。CRS組可見腎小球硬化，腎小管上皮細胞空泡變，系膜細胞和基質增生，腎小球毛細血管袢閉塞，間質內可見大量炎細胞浸潤；心肌細胞可見大量心肌細胞水腫壞死，基質內見可見大量炎細胞浸潤。A組腎小球可見局灶節段性硬化，個別腎小球粘連，部分腎小管上皮細胞再生，間質內炎細胞浸潤較CRS組有所減少；心肌細胞排列正常，少數細胞腫脹，間質內炎細胞浸潤較CRS組明顯減少。B組可見腎小球硬化，腎小管蛋白管型；心肌心態基本正常，心肌間質水腫較輕、炎細胞較少。C組可見部分腎小球毛細血管襻擴張，腎小管萎縮不明顯，部分擴張的腎小管內可見蛋白管型，間質內炎細胞較少，呈小灶狀浸潤；心肌細胞結構完整、個別出現腫脹，基質水腫較輕、其內炎細胞浸潤較少。與N組比較，A、B、C、CRS組CVF顯著升高(P<0.05)；與C組比較，A、B、CRS組CVF顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

2.5心臟、腎臟組織的透射電鏡檢查結果 N組細胞核形態規則，大部分線粒體形態良好，嵴清晰；CRS組細胞核形態欠規則，線粒體變形、溶解；A組相對于CRS組細胞核形態較規則，線粒體腫脹但溶解較少；B組細胞核較規則，線粒體腫脹明顯，可見溶解的線粒體；C組細胞核規則，線粒體腫脹程度明顯降低，溶解的線粒體較少，嵴可見。N組顯示心肌細胞結構完整，細胞核形態規則，呈圓形，核仁清，染色質分布較為均勻，肌節形態整齊、邊界較清，線粒體形態正常，呈長橢圓形，無自噬小泡；CRS組肌節排列紊亂，較多肌節斷裂溶解，間質纖維化并有大量炎細胞浸潤，細胞核形態不規則、部分細胞核破裂，核內染色質呈塊狀聚集，大量線粒體腫脹或溶解、嵴斷裂、空泡化嚴重，有明顯的自噬小泡形成；A組心肌細胞結構稍腫脹、形態結構基本完整，基質中可見少量炎細胞浸潤，部分線粒體膜損傷且有較多自噬小泡形成；B組心肌細胞線粒體腫脹、形態結構基本完整，肌節間隙較大，基質中少量炎細胞浸潤線粒體損傷較輕，自噬小泡數量降低；C組心肌細胞形態完整、稍腫脹，細胞核形態呈圓形，核仁較清晰，染色質呈團塊狀分布，線粒體形態稍腫脹，自噬小泡數量較少。見圖3。

表2 各組心臟及腎臟病理、 心肌CVF及心肌TUNNEL結果

圖2 各組心臟及腎臟病理結果及心肌CVF

2.6心臟與腎臟的細胞凋亡檢查結果 TUNNEL結果表明，N組腎組織切片可見腎小球腎小管結構完整，幾乎未見凋亡細胞；與N組相比，A、B、C組凋亡細胞明顯增多，其中A組最多，C組相對較少，B組凋亡細胞數量介于二者之間，且腎組織的凋亡細胞主要分布在腎小管區域。見表2、圖4。

圖4 各組心肌TUNEL結果(×200)

3 討 論

CRS包括心臟和腎臟的多種疾病，指一個器官的功能障礙導致另一器官的急性或慢性功能障礙〔7〕。CRS的發病機制復雜，包括交感神經過度興奮、腎素-血管緊張素-醛固醇系統(RAAS)過度激活、氧化應激、炎性反應、血流動力學異常等。Ⅳ型CRS又稱慢性心腎綜合征，其主要特征是由CKD導致心臟的慢性功能不全。隨著CKD的進展，高血壓、肺水腫等反應可引起心臟負荷增加，同時電解質紊亂、交感神經興奮、缺血缺氧等進一步加重心肌損傷并最終導致心功能下降〔8〕。目前臨床針對CRS常用的治療方式是利尿、透析、血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑(ACEI/ARB)等，雷米普利是常用的ACEI類藥物，可有效抑制RAAS的激活，同時增加緩激肽的水平，舒張血管、調節血壓，對CKD誘導的心室肥大和心肌纖維化具有較好的修復作用。已有的研究證明5.0 mg/(kg·d)劑量的雷米普利灌胃對大鼠心臟疾病的治療效果較佳〔9〕，本實驗采用5.0 mg/(kg·d)為治療劑量。隨著再生醫學的發展，干細胞逐漸被應用于細胞生物學工程。BMSCs作為干細胞家族的主要成員，以其易分離性、多能性和無倫理爭議的特點已被應用于組織修復和再生領域〔10〕。現已證明BMSCs可抑制損傷組織中的炎癥反應，同時在多種趨化因子的綜合作用下向靶器官和靶組織遷移，并定向分化為相應組織細胞，參與受損器官或組織的修復過程〔11,12〕。實驗證明，BMSCs對靶器官的修復作用主要表現在移植早期，且移植后第1周末與第2周末的修復作用無顯著差異〔13,14〕，故本實驗的檢測點選擇在BMSCs移植后第1周末。

以往研究表明〔15〕經腎動脈移植BMSCs的歸巢效果優于外周靜脈與腎包膜下直接注射，對CKD的治療效果更佳，故本實驗采用經腎動途徑移植BMSCs。BUN和Scr是衡量CRS嚴重程度的靈敏指標，腎臟受損患者常在早期出現BUN、Scr可顯著升高，經有效的治療后隨著腎功能的恢復，二者又可下降。本實驗結果推測BMSCs在治療早期可通過歸巢分化及旁分泌等多種機制對CKD大鼠腎臟電荷屏障起到較好的修復作用。

本研究結果證實了BMSCs對CRS的修復作用不僅表現在對心肌本身的修復，同時也體現在對腎臟的修復。Chen等〔16〕證明了間充質干細胞可改善受損的腎臟腎小球肥大，腎小管上皮細胞空泡化等改變，同時減輕腎小球內細胞外基質沉積，減輕腎小球與腎小管間質纖維化并降低受損腎臟腎固有細胞的凋亡率。已有的研究證明間充質干細胞主要通過兩種機制起到抗凋亡的作用，分別為：①間充質干細胞分泌各種生長因子，例如胰島素樣生長因子(IGF)-1、血管內皮細胞生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子(HGF)等〔17～19〕；②間充質干細胞及其分泌的外泌體增加了抗凋亡基因的表達并促進mRNA轉移到受損細胞中〔20,21〕。受損的線粒體可通過激活細胞的自噬過程對心肌造成損傷〔22〕，本研究結果證明，BMSCs可通過抑制凋亡從而對CRS進程中的心臟與腎臟起到較好的修復作用。同樣證實了雷米普利對CRS的治療效果主要通過改善心肌重塑實現，而BMSCs對CRS患者心肌重塑和抑制細胞凋亡與自噬均有作用。