沉默RORα通過(guò)活化Wnt/β-catenin通路靶基因促進(jìn)人胃癌細(xì)胞增殖

裴大兵 張翼臻 劉芳 蘇堅(jiān),3 夏紅 蘇琦

(1南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所 湖南省腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省胃癌研究中心，湖南 衡陽(yáng) 421001；2井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院普外科；3南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科)

胃癌全球發(fā)生率與死亡率分別居于惡性腫瘤第五位與第三位，其中約44%的胃癌發(fā)生在中國(guó)〔1,2〕。因?yàn)槲赴┰缙诎l(fā)現(xiàn)困難，中晚期患者常常侵襲轉(zhuǎn)移，治療效果較差，5年生存率低〔2〕。因此，探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制是非常關(guān)鍵的問(wèn)題。維甲酸相關(guān)孤核受體(RORs)的家族成員之一RORα，在多種腫瘤中低表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，并且可能是乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌和胃癌等腫瘤的靶點(diǎn)〔3〕。RORα高表達(dá)可抑制人胃癌MGC803細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)素(catenin)信號(hào)通路靶基因表達(dá)〔4〕。并且，沉默RORα可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔5〕。本文研究敲低RORα是否促進(jìn)胃癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)。

1 材料與方法

1.1抗體與主要試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RNA提取試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；RORα抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體與β-actin抗體(Abcam公司)；β-catenin、p-β-catenin、Wnt-1、轉(zhuǎn)錄因子(TCF)-4、Axin、c-Jun、c-Myc抗體與電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Santa Cruz公司)；細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和羊抗小鼠IgG-HRP(凱基生物公司)；免疫共沉淀試劑盒(Pierce公司)；羊抗小鼠IgG(H+L)(protech生物公司)；c-Myc-pGL-3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由廣州賽業(yè)生物公司提供。新生牛血清(杭州四季青生物公司)；引物由上海生工公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌MGC803細(xì)胞系(胃低分化黏液癌細(xì)胞)由中南大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)，沉默RORα的MGC803細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建〔5〕。在加入10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI1640中培養(yǎng)。分為MGC803組、空載體組和RORα敲低組。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)檢測(cè)沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MGC803細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞貼壁8 h后，更換為RPMI1640培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液，培養(yǎng)4 h，吸去全部上清液，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解。置酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)各孔吸光值，波長(zhǎng)光密度(OD570 nm)。

1.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子 采用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，AMV 酶逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，PCR引物序列：RORα正義：5′-GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC-3'、反義：5′-CAGTTGGGGAAGTCTCGCCG-3′，151 bp。Wnt1正義：5′-TGCACGCACACGCGCGTACTGCAC-3′、反義：5′-CAGGATGGCAAGAGGGTTCATG-3′，400 bp。β-catenin正義：5′-GTTGTACCGGAGCCCTTCAC-3′、反義：5′-TCCCACCCTACCAACCAAGT-3′，729 bp。Axin正義：5′-AGCCGTGTCGGACATGGA-3′、反義：5′-CCTCAAACACCACCCCACAG-3′，254 bp。c-Myc正義：5′-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3′、反義：5′-CTGCTTGGACGGACAGGATG-3′，323 bp。c-Jun正義：5′-CGCACCGGTTGTTGAACTTG-3′、反義：5′-ATGCCTCCCGCACTCTTACT-3′，292 bp。MMP-9正義：5′-GTGCTGGGCTGCTGCTTTGCTG-3′、反義：5′-TGGGGTTCGCATGGCCTTCA-3′，255 bp。β-actin正義：5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′、反義：5′-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3′，498 bp。PCR與文獻(xiàn)相同〔4〕。

1.5Western印跡檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上通過(guò)裂解液徹底裂解1 h后低溫離心收集細(xì)胞蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)取蛋白濃度，經(jīng)過(guò)上樣緩沖液高溫變形后，通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜。脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗后加一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗后二抗孵育1 h，通過(guò)ECL獲得結(jié)果。

1.6免疫共沉淀 按照免疫共沉淀試劑盒說(shuō)明書(shū)收集樣本蛋白。將RORα抗體加入細(xì)胞裂解物，4℃過(guò)夜，加入含蛋白G的旋轉(zhuǎn)柱上，孵育30 min，2 000 r/min離心3 min，棄去濾過(guò)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加洗脫液洗2次，獲得抗體復(fù)合物，加上樣緩沖液，SDS-PAGE，進(jìn)行Western印跡。

1.7熒光素酶報(bào)告基因分析 制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù),以3×104/cm2的細(xì)胞數(shù)量種入24孔板，c-Myc-pGL-3英光素酶報(bào)告質(zhì)粒用脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。加入裂解液，離心，加入熒光素酶底物。采用液體閃爍儀檢測(cè)熒光值，相對(duì)熒光素酶活性=熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測(cè) 48 h后，RORα敲低組增殖能力較MGC803組和空載體組(miR/MGC803)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表1。表明敲低RORα可促進(jìn)MGC803細(xì)胞增殖能力。

2.2沉默RORα對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響 RORα敲低組Wnt1 mRNA(2.90±0.3)較MGC803組(0.71±0.3)與空載體組(0.81±0.2)顯著上調(diào)(P<0.05)；RORα敲低組Wnt1蛋白(1.15±0.31)較MG803組(0.65±0.32)與空載體組(0.70±0.10)顯著上調(diào)(P<0.05)。但RORα敲低組(1.06±0.31)、MGC803組(1.13±0.28)、空載體組總β-catenin蛋白(1.18±0.25)與RORα敲低組(1.17±0.31)、MGC803組(0.96±0.52)、空載體組β-catenin mRNA(1.18±0.25)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。免疫共沉淀顯示，RORα敲低組(0.42±0.21)較MGC803組(1.53±0.50)與空載體組RORα與β-catenin結(jié)合(1.62±0.51)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。Western印跡檢測(cè)顯示，RORα敲低組(0.32±0.25)較MGC803組(0.18±0.18)與空載體組核內(nèi)β-catenin(0.19±0.20)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3。并且RORα敲低組TCF-4蛋白(1.42±0.53)較MGC803組(0.63±0.42)與空載體組(0.67±0.34)明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。表明沉默RORα可上調(diào)Wnt1，與β-catenin結(jié)合減少，從而增加β-catenin入核，繼而上調(diào)TCF-4表達(dá)。

表1 沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的 影響

1:MGC803組;2:空載體組;3:RORα敲低組；圖3、4、5同圖1 沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞Wnt1、 β-catenin表達(dá)的影響

1:IgG;2:MGC803組;3:空載體組;4:RORα敲低組圖2 免疫共沉淀檢測(cè)沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞 RORα與β-catenin結(jié)合的影響

圖3 沉默RORα對(duì)核內(nèi)β-catenin表達(dá)的影響

圖4 沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞TCF-4蛋白表達(dá)的影響

2.3沉默RORα促進(jìn)Wnt/β-catenin通路靶基因表達(dá) RORα敲低組較MGC803組、空載體組c-Myc、c-Jun、Axin、MMP-9 mRNA與蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5，表2；提示沉默RORα可促進(jìn)Wnt/β-catenin通路靶基因表達(dá)。

2.4沉默RORα增強(qiáng)c-Myc啟動(dòng)子活性 MGC803組(1 500±0.98)與空載體組c-Myc啟動(dòng)子活性(1 497±0.78)明顯低于RORα敲低組(2 536±0.59，P<0.05)。提示敲低RORα能夠增強(qiáng)c-Myc啟動(dòng)子活性。

表2 沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞Wnt/β-catenin通路靶基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，RORα在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)表達(dá)明顯低于正常上皮細(xì)胞，并且與分化程度、臨床分期和不良生存率明顯有關(guān)。沉默RORα可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖與裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，下調(diào)p53表達(dá)與抑制p53磷酸化。相反，RORα高表達(dá)可明顯抑制增殖與移植瘤生長(zhǎng)，上調(diào)p53與磷酸化水平〔6〕。在紫外線誘導(dǎo)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)RORα下調(diào)，轉(zhuǎn)錄組分析、生物信息學(xué)分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明RORα是cSCC進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。并且，RORα通過(guò)下調(diào)S100a9和Sprr2f表達(dá)，進(jìn)而抑制cSCC細(xì)胞增殖和遷移〔7〕。研究顯示，食管癌組織與細(xì)胞中，較正常組織與細(xì)胞RORα明顯下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)RORα基因啟動(dòng)子區(qū)域被甲基化。采用甲基化抑制劑5aza-2-dc處理后，RORα mRNA與蛋白表達(dá)上調(diào)，而RORα高表達(dá)或激活可抑制腫瘤細(xì)胞增殖〔8〕。ROR-α-1高表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并下調(diào)β-catenin、c-Myc、CyclinD1和N-cadherin水平，提示ROR-α-1具有抑制肝癌的作用〔9〕。

研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌進(jìn)展中起重要作用〔10〕。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵因子及其下游效應(yīng)因子在腫瘤起始、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性中的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用〔11〕。wnt/β-catenin通路的失調(diào)常誘發(fā)EMT，導(dǎo)致癌細(xì)胞失去上皮表型而獲得間充質(zhì)表型的過(guò)程，促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲，可能是腫瘤治療靶點(diǎn)〔12,13〕。有學(xué)者報(bào)道，在乳腺癌中RORα低表達(dá)，而促進(jìn)其高表達(dá)后，可通過(guò)與β-catenin結(jié)合下調(diào)Wnt/β-catenin 靶基因表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲，提示RORα可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin靶基因抑制乳腺癌進(jìn)展〔14〕。不僅如此，PGE2/蛋白激酶(PK)Cα可磷酸化RORα，從而抑制Wnt信號(hào)通路下游基因CyclinD1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明RORα是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子〔15〕。miR-1246在肝癌中高表達(dá)，其靶基因是RORα，miR-1246高表達(dá)和RORα低表達(dá)是侵襲性肝癌的顯著特征。miR-1246高表達(dá)或沉默RORα可通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路在體內(nèi)外增強(qiáng)肝癌的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移和促進(jìn)EMT〔16〕。RORα在胃癌中低表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著有關(guān)，其機(jī)制是由于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性降低，而AMPK可通過(guò)轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾調(diào)控RORα。研究報(bào)告，AMPK活化劑AICAR可增強(qiáng)RORα活性與表達(dá)，上調(diào)p21、SEMA3F等抑癌基因表達(dá)。表明AMPK的活化劑可能對(duì)治療胃癌具有價(jià)值〔17〕。

結(jié)果表明RORα可能是胃癌治療的靶點(diǎn)。目前，研發(fā)RORα的激動(dòng)劑或有效藥物成為治療腫瘤的新策略〔14〕。研究表明，姜黃素是一種可以抑制Wnt/β-catenin通路，并減緩胃癌發(fā)展進(jìn)程的傳統(tǒng)中藥單體〔18〕。綠茶中的多酚EGCG也可以通過(guò)失活Wnt/β-catenin通路，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡來(lái)抑制胃癌發(fā)展〔19〕。研究指出，亞硒酸鈉可通過(guò)增強(qiáng)SBP1表達(dá)來(lái)抑制Nrf2和Wnt/β-catenin通路的活性，從而阻礙癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)〔20〕。類(lèi)似的，吳茱萸堿(Evodiamine)可通過(guò)干預(yù)Wnt/β-catenin通路活性，抑制Sox2、KLF4、Bmi1和Oct4的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌干細(xì)胞的特征從而下調(diào)奧沙利鉑耐藥，并且還可抑制Slug、Twist、Zeb1和Vimentin的水平，逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程〔21〕。維生素D羥基衍生物20(OH)D3和1,20(OH)2D3可通過(guò)失活Wnt/β-catenin信號(hào)通路下調(diào)β-catenin核易位抑制OSCC CAL-27的生長(zhǎng)〔22〕。并且，維生素D羥基衍生物和RORα激動(dòng)劑SR1078可抑制卵巢癌的增殖和干性〔23〕。SR1078可通過(guò)上調(diào)RORα表達(dá)抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔24〕。

研究顯示，二烯丙基二硫(DADS)是來(lái)自大蒜中的一種脂溶性烯丙基硫化物有效成分，在多種腫瘤中都具有明顯的抗癌作用〔25〕。DADS可通過(guò)抑制Rac1-Pak1/Rock1/LIMK1通路來(lái)阻礙胃癌細(xì)胞的EMT〔26〕。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，DADS可促進(jìn)人胃癌MGC803細(xì)胞中RORα表達(dá)〔27〕。然而，DADS是否也可通過(guò)RORα導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路失活，從而作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)尚待深入研究。