SSEA-4在不同分期卵巢腺癌中表達及與化療耐藥和預后相關性

劉忠杰 宋永禎 王菲 范鳳霞 王靜 趙寧 畢鳳玲 李桂芬

(衡水市人民醫院 1婦科，河北 衡水 053000；2體檢科；3衡水市第五人民醫院婦產科)

卵巢癌(EOC)早期患者可達到90%的5年生存率，晚期發生轉移的EOC患者僅29%生存率〔1,2〕。同時因該病具有早期癥狀不明顯等特點且卵巢位于盆腔深部，故70%EOC患者確診即為晚期，因此EOC具有占婦科惡性腫瘤首位的病死率，對女性健康具有嚴重威脅〔3,4〕。近10年隨著手術治療聯合化療治療方案的應用，死亡率并未得到顯著改善，多藥耐藥性是其中一項重要原因。研究表明約25%的卵巢腺癌患者發生原發性耐藥，75%發展繼發性耐藥，因此尋找卵巢腺癌耐藥性的特異性生物指標是急需解決的問題〔5,6〕。且EOC的發生發展受多基因共同決定，其的病情評估、早期篩查及預后判斷亦需要較靈敏的腫瘤標記物。階段特異性胚胎抗原(SSEA)-4是存在于胚胎干細胞(ESCs)及內細胞群細胞(INC)表面〔7〕，多糖抗原的一種，可作為未分化細胞的表面標志〔8〕，近年來多研究表明乳腺癌等惡性腫瘤的發生發展與SSEA-4密切相關〔9,10〕，但卵巢腺癌與SSEA-4的相關研究尚缺少證據。本研究探討不同分期的卵巢腺癌中SSEA-4表達及其與化療耐藥和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 以2012年1月至2016年1月衡水市人民醫院收治的卵巢腺癌患者155例，所有患者經病理學確診后行手術治療且術前未經其他治療，術后行化療。入選患者按國際婦產科聯盟(FIGO)標準分組：Ⅰ～Ⅱ期組(57例)、Ⅲ期組(75例)、Ⅳ期組(23例)。納入標準：①具有完整的臨床及隨訪資料；②無既往婦科手術史；③無既往放化療、免疫治療史且如愿親未接受過抗腫瘤藥物治療；④術后采取正規化療方案。排除標準：①合并患有慢性或代謝病者；②其他惡性腫瘤或者影響本研究的其他生殖系統疾病。本研究通過倫理審批，且所有患者簽署知情同意書。

1.2免疫組化(SP)法檢測組織中SSEA-4表達 所有患者行手術治療，取病灶組織。運用SP法對組織內SSEA-4表達進行檢測，通用型SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人SSEA-4抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。具體步驟：甲醛對標本進行固定后用石蠟包埋。切4 μm厚度薄片后使用梯度酒精及二甲苯進行脫蠟， 15 min H2O2處理組織切片，后進行微波抗原修復，再自然降溫封閉后，抗人1∶50稀釋的多克隆SSEA-4抗體滴加，4℃過夜。通用型二抗工作液滴入，37℃條件下30 min；后SP工作液滴加，37℃條件下15 min；后運用AEC進行顯色，蘇木素進行復染后封片。閱片采用雙盲方法。

1.3判讀標準 根據陽性著色程度積分綜合計算：1分：弱陽性(+)；2分：中等陽性()；3分：強陽性()。根據陽性細胞數賦分如下：1分：<25%的細胞呈弱陽性(+)數；2分：25%～49%的細胞呈中等陽性()數；3分：≥50%的細胞呈強陽性()數。上述兩者乘積<3為陰性，≥4為陽性，共觀察5個高倍鏡視野(HP)后取平均。

1.4化療療效評定 本研究采用鉑類+紫杉醇行的EOC一線化療方案系統治療所有患者，間隔21 d每療程，所有患者6～8個療程，在停止化療4 w以上對患者進行療效評價。根據B超、CT或二次探查術結合盆腔檢查、腹部檢查、腫瘤標記物水平〔糖類抗原(CA)125、癌胚抗原(CEA)、CA199等〕進行療效評價。化療療效標準〔3〕：完全緩解(CR)：腫瘤完全消失至少4 w；為部分緩解(PR)：腫瘤縮小>50%且疾病至少4 w無進展；穩定(SD)：至少4 w腫瘤縮小≤50%，腫瘤增大≤25%；疾病進展(PD)出現新病灶或腫瘤增大>25%。在第6或第8個療程結束后對患者進行化療反應評價：化療無效：SD+PD；化療有效：CR+PR。以下情況出現即為化療耐藥：①臨床癥狀在初次化療后未消失，有包塊通過B超和盆腔檢查，未有下降至正常臨床證實緩解狀態的血清CA125；②短期內有效在初次化療后但復發出現在化療結束后6個月以內的相對較短時間。

1.5隨訪 患者治療后達到臨床CR后定期進行門診復查，生存期以電話形式進行隨訪。復發為半年后出現以下現象：胸腹水、腫瘤標記物、不明原因腸梗阻或影像學檢查或查體發現腫塊、隨訪率為100%。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析或χ2檢驗。

2 結 果

2.1不同分期及SSEA-4表達的卵巢腺癌患者一般資料比較 不同分期卵巢腺癌患者淋巴轉移及腹水差異有統計學意義(P<0.05)；不同腹水及淋巴結轉移情況SSEA-4陽性表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同分期及SSEA-4表達患者一般資料比較〔n(%)〕

2.2SSEA-4在不同分期卵巢腺癌組織中表達情況 SSEA-4在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期卵巢腺癌中陽性表達〔34例(59.65%)、64例(85.33%)、22例(95.65%)〕差異顯著(χ2=17.674，P=0.000)。見圖1、圖2。

圖1 SSEA-4在卵巢腺癌中陽性表達(HE染色，×100)

圖2 不同分期SSEA-4蛋白在卵巢腺癌中表達

2.3SSEA-4表達與近期化療反應的關系 SSEA-4陰性表達組化療有效及化療敏感性顯著高于SSEA-4陽性組(P<0.001)。見表2。

表2 SSEA-4表達與近期化療反應的關系〔n(%)〕

2.4不同預后患者SSEA-4表達水平比較 SSEA-4陽性表達患者死亡及復發〔69例(95.83%)〕較SSEA-4陰性表達患者〔3例(4.17%)〕顯著偏高(χ2=29.403，P=0.000)，即SSEA-4陽性表達越高，患者預后越差。

2.5不同SSEA-4表達患者生存率比較 SSEA-4陽性組3年生存率、5年生存率顯著低于SSEA-4陰性組(P<0.05)，1年生存率差異無統學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同SSEA-4表達患者生存率比較〔n(%)〕

2.6SSEA-4表達與不同卵巢腺癌分期患者化療情況及預后的相關性 SSEA-4陽性表達、不同卵巢腺癌分期與患者化療有效、耐藥性、復發均呈顯著正相關(P<0.05，P<0.001)，見表4。

表4 SSEA-4表達與患者分期及預后的相關性

3 討 論

卵巢惡性腫瘤發病率居于婦科惡性腫瘤中第3位，僅次于宮頸癌及子宮內膜癌，具有發病隱匿、易侵襲、易轉移等特點，近年來發病越來越趨于年輕化〔11，12〕。5年生存率僅為20%～30%，居婦科腫瘤死亡率第1位〔13〕，究其死亡率高的原因可能為如下兩方面：一是缺乏早期篩查、病情評估及預后判斷的指標，大部分患者確診即為中晚期〔14〕；二是腫瘤的化療耐藥性〔15〕。可見以上兩點是領域內關于疾病發生發展的重點與熱點。SSEA-4作為女性惡性腫瘤中具有明顯異常表達的指標〔16〕，其在卵巢癌患者中亦存在異常表達〔16〕，但兩者在不同分期卵巢腺癌中的表達研究及對預后及化療耐藥性的反應價值仍相對較不足〔17〕。

有研究表明，EOC發生的誘因可能是長期的不間斷排卵〔18〕，本研究結果與國外相關研究結果相一致〔19〕，提示卵巢腺癌的發生可能和絕經及妊娠次數無關。SSEA-4在腫瘤環境的發展或維持中具有潛在作用〔20〕，SSEA-4也被證明在乳腺和卵巢腫瘤的化療耐藥和腫瘤干細胞群體中表達〔21〕，這與本研究結果類似。提示SSEA-4可能參與了卵巢腺癌的發生發展過程，與腫瘤轉移及腹水密切相關，這與大部分以往研究結果相一致〔22,23〕。其機制可能與SSEA-4參與人原始生殖細胞(PGCs)的自我更新、增殖及多向分化有關，而PGC遷移到未來的性腺嵴，在那里它們隨著性腺進行性別決定而定居。在性腺中，PGC分化為雄性生殖腺、雄性生殖腺或雌性生殖腺〔24〕。分析SSEA-4與卵巢癌發生發展的關系可能與其對PGCs的調節作用有關，具體作用機制還需進一步研究。

本研究中相關性分析結果提示，SSEA-4的表達狀態可作為患者對化療耐藥性及預后的預測指標。且多項文獻報道SSEA-4表達與多種癌癥的化療藥物療效具有顯著相關性，可作為預后指標之一〔25,26〕。關于SSEA-4對耐藥性的影響，有可能因為SSEA-4在控制細胞增殖及凋亡的基礎上，增強了其耐藥性等因素的影響，其具體作用機制仍需要進一步基礎研究明確。

綜上，SSEA-4在卵巢腺癌中的表達與腫瘤分期顯著相關，其在不同分期卵巢腺癌中的差異性表達可能參與了卵巢腺癌的發展過程，可作為卵巢腺癌惡行程度的評價指標。SSEA-4與患者化療耐藥及預后顯著相關，其表達強度可有效反映患者對化療的敏感程度，可作為化療耐藥及預后的指標，可能成為卵巢腺癌腫瘤惡性程度、近期化療療效及遠期預后的有效指標。